Способ ингибирования активности вируса иммунодефицита человека

9) КЦ (11)1) Б А 61 К 39 00 ПИСАН ОБРЕТЕ К ПАТЕН Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам(54) СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИВИРУСА ИМВЛУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА(57) Изобретение относится к медицине, в частности к инфекционным заболеваниям, и может бытьиспользовано для профилактики и лечения синдроиммунодефицита (СПИД). вляется повышение эффектив- ВИЧ и удешевление способа Цель достигается тем, что в для ингибирования активности оксирибонукпеиновую кислоту человека, облученную ультраьзуют антитела к облученной оксирибонуклеиновой кислоте человека. 4 табл. ма приобретенного Целью изобетения я ности ингибирования его ингибирования. качестве препарата ВИЧ используют дез из лимфоцитов крови фиолетом или испол ультрафиолетом дез из лимфоцитов кровиИзобретение относится к медицине, в протеазы. эндонуклеазы) невозможно пред- частности к инфекционным заболеваниям, и отвратить, либо существенно уменьшить может быть использовано для профилакти- встраивание генетического материала ВИЧ ки и лечения синдрома приобретенного им- в генетические структуры лимфоцитов, помунодефицита (СПИД), 5 ражаемых вирусом. Установлено, что именИзвестен способ ингибирования актив- но облученная ультрафиолетом ДНК иэ ности вируса иммунодефицита человека с лимфоцитевчеловекаиантителакнейоблапомощью химических препаратов естест- дают способностью ингибировать один из венного происхождения. ферментов, наиболее значимых для взаимоНедостаткамиданногоспособаявляют действия ВИЧ с лимфоцитами - Уф-эндося низкая подавляющая способность препа- нуклеазу лимфоидных клеток,ратов в отношении ВИЧ и вцсокая их Способ реализуется следующим обрастоимость. зом. Из периферической крови здоровых доЦель изобретения заключается в повы- норов, стабилизированной гепарином, с шении эффективности ингибирования ак помощью иэопикнического центрифугиротивности ВИЧ и удешевлении способа ее вания в градиенте плотности фиколл-изопак ийгибирования. (б 1,077) выделяют лимфоциты. Клетки стиЦель достигается тем, что в качестве мулируют фитогемагглютинином Р(ОИсо) в препарата для ингибирования активности течение 72 ч и поддерживают в среде ВРМ 1- ВИЧ используют дезоксирибонуклеиновую 20 1640 с добавлением 10-ной эмбриональкислоту из лимфоцитов крови человека, об- ной телячьей сыворотки, 100 ед/мл лученную ультрафиолетом, или используют пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и антитела к дезоксирибонуклеиновой кисло -ного интерлейкина(В 1 о 1 езс). Культуте из лимфоцитов крови человека, облучен- ры клеток инкубируют в лунках 24-луночноной ультрафиолетом. 25 го планшета (2 мл/лунку) при 37 С вОбработка дезоксирибонуклеиновой СО 2-инкубаторе,кислоты (ДНК) ультрафиолетом известна. Лимфоциты крови человека центрифуОднако при этом ДНК выделяют не из лим- гируют 15 мин при 13009, осадок помещают фоцитов крови человека, а из бактериофа- в экстрагирующий буфер (10 мм трис-НС 1, гов или бактерий, при этом облученную 30 рН 8,0; 100 мМ ЭДТА; 20 мкг/мл панкреатиультрафиолетом ДНК используют только ческой РНКазы; 0,5 додецилсульфаа накак исходный субстрат для определения ак- трия) и инкубируют 1 ч при 37 С. После тивности некоторых ферментов. инкубации добавляют протеиназу К (до 100Получение антител к ДНК, облученной мкг/мл). Суспензию нагревают до 50 С, ультрафиолетом, также известно, ф 35 охлаждают, добавляют равный объем феОднако антитела к облученной ультра- нола, насыщенного 0,5 М трис-НС 1-буфефиолетом ДНК из лимфоцитов крови чело- ром, рН 8,0 и диализируют водную фазу века до сих пор не были получены и против 0,05 М трис-НС-буфера, рН 8,0, соописаны. Известные антитела к облученной держащего 0,01 М ЭДТА, Из полученного ультрафиолетом ДНК используют только 40 раствора готовят раствор ДНК концентрадля связывания с облученной ДНК в анэли- ции 100 мкг/мл.тических целях, Полученный раствор облучают ультраСовременные препараты, используе- фиолетом с помощью бактерицидной лампы мые для ингибирования активности ВИЧ, (длина волны 254 нм).в дозе 500 1/м мин. направлены либо на прямое блокирование 45 Антитела к ДНК из лимфоцитов челове- вирусного генетического материала (так на- ка, облученной ультрафиолетом, получают зываемые "антисмысловые" РНК), либо на путем трехкратной иммунизации кроликов в угнетение активности вирусных ферментов, дозе 50 мкг на один этап иммунизации на необходимых для обеспечения жизненного одно животное. Кровь забирают из краевой цикла ВИЧ (азидотимидин, производные 50 вены уха, отделяют сыворотку центрифугидезоксинуклеотидов, рибавирин, интерфе- . рованием при 13009, получают фракцию имроны и др.). муноглобулинов осаждением сульфатаНи один из способов ингибирования ак- аммония, диализируют против 0,1 М фостивности ВИЧ, непредусматриваетвлияния фатного буфера, рН 7,5 и выделяют необхона Ферментные системы лимфоидных кле. 55 димые антитела с помощью аффинной ток, необходимые для ранних этапов взаи-, хроматографии на сефарозе 4 В, связанной модействия генетического аппарата ВИЧ и с окисленной перманганатом калия (1,5 генетического материала лимфоцитов-ми- ммоль, 4 С, 30 мин) ДНК йэ лимфоцитов веней ВИЧ. Без воздействия на эти фер- крови человека, Элюцию антител с ДНК-сементные системы (внутриядерные фарозы осуществляют 0,1 М ацегатным бу 2004249фером, рН 5,0, Из полученного элюата гото- параметра. отражающего жизнеспособностьвят рабочий раствор антител в концентра- клеток,выбираютотношениеОП 540 висследуции 10 мкг/мл. емой пробе к ОП 540 в пробе клеток. не инфиВ лунку 24-луночного планшета вносятцированных ВИЧ, выраженное в процентах,1 мл суспензии активированных лймфоци Результаты исследования приведены етов крови человека (5 10 клеток/мл) и су- табл. 1, 2, 3.4пернатант культузоальной жидкости, Приведенные данные свидетельствуютсодержащий ВИЧ (10 частиц/мл). После 1 ч о повышении жизнеспособности клеток иинкубации(37 С, постоянное встряхивание) следовательно об ингибировании активноклетки отмывают, доводят их концентрацию 10 сти ВИЧ под влиянием интерферона,до 5 10 в 1 мл и далее к 1 мл такой Сравнивая данные табл, 1 и 2, можноасуспензии добавляют 1 мл раствора ДНК видеть,чтоиспользованиеДНКизлимфоцииз лимфоцитов человека, облученной ульт- . тов человека, облученной ультрафиолетом,рафиолетом (10 мкг/мл) или 1 мл раствора достоверно интенсивнее(р0,05) ингибируантител к ДНК иэ лимфоцитов человека, об ет активность ВИЧ, чем применение а-ин-лученной ультрафиолетом (1 мкг/мл); терферона, .особенно на поздних стадиях .Эффективность ингибирования активно- инфекционного процесса.сти ВИЧ оценивают по изменению уровня Сравнивая данные табл, 1, 2 и 3, можножизнеспособности клеток, инфицированных сделать вывод, что применение антител кВИЧ, которое развивается под влиянием ан ДНК из лимфоцитов человека, облученнойтивирусных воздействий по способу-прото- ультрафиолетом, достоверно (р0,001) интипу и заявляемому способу. тенсивнее ингибирует активность ВИЧ, чемПараметром жизнеспособности клеток применение а-интерферона, и даже интенслужит их способность восстанавливать 3- сивкее, чем использование самой ДНК иэ(4,5-диметилтиазол-ил)-2,5-дифенилтетра лимфоцитов человека, облученной ультразолий бромид(МТТ) с образованием водоне- фиолетом.растворимого темно-синего формазана, Есть основания полагать, что такой зфимеющего максимум поглощения света при фект заявляемого способа связан с установ 540 нм, Данный метод является быстрым ленным сильным ингиирующим влияниемскрининговым тестом, удобным для оценки 30 ДНК из лимфоцитов человека, облученнойкак патогенного действия ВИЧ, так и токси- ультрафиолетом, и антител к ней на активческого влияния противовирусных препара- ность лимфоцитарного фермента УФ-эндотов на лимфоциты. нуклеазы, необходимой для ранних этаповВ соответствии со способом-прототи- взаимодействия ВИЧ и лимфоцитов-мишепом к клеточной культуре, содержащей 35 ней(см. табл.4),ВИЧ, добавляют 1 мл раствора а-интерфе- Из данных табл. 4, следует, Что воздейрона(100 ед./мл) в среде КРМ. Каждый ствие по способу-прототипу не сопровождаопыт ставят в трех параллельных пробах. ется каким-либо влиянием на активностьВ соответствии с заявляемым способом . УФ-эндонуклеазы, .к клеточной культуре, содержащей ВИЧ, до Весьма важным представляется тотбавляют 1 мл раствора ДНК из лимфоцитов факт, что антитела к ДНК иэ лимфоцитовчеловека, облученной ультрафиолетом (10 человека, облученной ультрафиолетом, ещемкг/мл) или 1 мл раствора антител к ДНК из интенсивнее ингибируют активност ВИЧ,лимфоцитов человека, облученной ультра- чем сама ДНК из лимфоцитов, облученнаяфиолетом (1 мкг/мл). Каждый опыт ставят в 45 ультрафиолетом, Это дает основания полатрех параллельных пробах, гать, что при использовании облучен ной ДНККаждые двое суток на протяжении 20 дн из лимфоцитов человека в организме больноиэ каждой пробы отбирают 100 мкл суспен- го будут образовываться антитела, обладаю- .зииклеток, помещают влунку 96-луночного щие тем же (и даже более выраженным)плоскодонного планшета и добавляют 10 50 антивирусным действием, что и исходныймкл 0,5 ф-ного раствора МТТ, Планшет ин- препарат(ДНК, облученная ультрафиолетом),кубируют в С 02-инкубаторе 4 ч при 37 С. т,е, названный исходный препарат можетПосле этого супернатант отсасывают, вно- . рассматриваться как потенциальная вакцинасят 150 мкл 0,04 н. раствора НС в изопро- против ВИЧ. Сказанноетем более важно, чтопаноле, который экстрагирует из клеток 55 антитела, образующиеся при введении в орформазан, и определяют оптическую плот- ганизм больного а-интерферона, обладаютность экстракта при длине волны 540 нм (ОП действием. противоположным эФфектам са 540) на спектрофотометре с вертикальным мого интерферона.пучком света (Мцсзап Роз). В качестве (56) Зава 1985,)о 1. 254: М 18, р. 2521, 2529.1 аблица 1Жизнеспособность клеток, инфицированных ВИЧ, на фоне применения а-интерферона Таблица 2)Кизнеспособность клеток, инфицированных ВИЧ, на фоне применения ДНК из лимфоцитов человека, облученной ультрафиолетомсобность клеток, инфицированных ВИЧ, на фоне применени к ДНК иэ лимфоцитов человбса, облученной ультрафиолетом10 2004249Таблица 4 Активность Уф-зндонуклеазы в лимфоцитах прови человека при воздействии по способу-прототипу и заявляемому способуСоставитеЪь И, БондаренкоГ. Мельникова Техред М.Моргентал Корректор М. Петрова Реда Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента035, Москва, Ж, Рэушская наб., 4/6 каз 33 изводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина Формул а из о бр ете ни я1. СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА путем обработки клеток химическим препаратом, отличающийся тем, что в качестве химического препарата используют дезоксирибонуклеиновую кислоту иэ лимфоц облученную ультр2. Способ по что в качестве х пользуют антител олетовым светом кислоте из лимфо итов крови человека, афиолетовым светом.п,1, отличающийся тем, имического препарата иса к облученной ультрафидезоксирибонуклеиновой цитов крови человека,