Способ определения кооперации гранулоцитов и моноцитов

,5 О 1 й 33/53 БРЕ Я ЬСТВУ и инс не обна НИЯ КО ОНОЦИ я к мед может мунног ит. Цель ужено, ОПЕРАТОВ цине, а ыть исстатуса иэобреИзобр тение от иммуно в оценк енно дл твия в э носится к мед логии, и может цине, в быть истуса чеушений ранулочастностипользованоловека, а ивзаимодей иммунного ста выявления нар ене моноцит ци изобрет ределен оцитов, осущест ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕАВТОРСКОМУ СВИД(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕЦИИ ГРАНУЛОЦИТОВ И М(57) Изобретение относитсименно к иммунологии, ипольэовано при оценке имв звене гранулоцит-моноц Целью еспособа оптов и гранулСпособ вляют следующим образом,Гепариниэированную (20 ЕД/мл) венозную кровь в объеме 5 - 6 мл наслаивают на 2мл раствора Фиколл - Гипак с плотностью1,114 г/см и центрифугируют при 400 д40 мин. Фракции мононуклеаров и гранулоцитов собирают отдельно и 3 раза отмываютизотоническим фосфатным буфером (ИФБ),рН 7,2. центрифугируя при 200 9 10 мин.Затем из осадка мононуклеаров приготавливают суспензию клеток 2 х 10 в мл на среде ВРМс 20-ной инактивированнойАВ (1/) сывороткой, 20 мМ глютамина и 100 ния является созданиеия кооперации моноцитения - определение кооперации гранулоцитов и моноцитов. Для достижения указанной цели используется капиллярный вариант реакции торможения миграции лейкоцитов иэ капиллярных трубок в присутствии моноцитов, при этом оценивают результат реакции через 6 ч и при повышении миграционной способности оценивают стимулирующее влияние моноцитов на гранулоциты, По изменению взаимоотношений в системе гранулоцит - моноцит можно определять иммунодефицитное состояние организма. мкг/мл гентамицина (КС). Суспензию в объеме 3 мл вносят в пластиковую чашку Петри и инкубируют при 37 С, 5-ным С 02 100- ный влажности в течение часа. Неприлипшие клетки удаляют, прилипшие осторожно прополаскивают 3 раза средой 199 и инкубируют при 4 С в течение 20 мин в среде ВРМ - 1640 с 10 мМ ЭДТА, Отслоившиеся клетки собирают, отмывают 3 раза средой 199 и ресуспендируют до концентрации 1 х 10 в мл. Морфологическая (окраска побРомановскому - Гимза) и цитохимическая (неспецифическая экстераза) оценки показали, что эта суспензия клеток на 82 - 89 СОСТОИТ Иэ МОНОЦИТОВ.Гранулоциты, полученные после центрифугирования крови в градиенте ФиколлГипак, отмывают 3 раза ИФБ и ресуспендируют до концентрации 1 х 10 в мл в среде ВРМ - 1640. Морфологический анализ показал, что эта суспензия клеток на 96 - 97 состоит из гранулоцитов, 1684 6534ИМ = --К Иэ о".лдка эри;ргщитов после 3 кра ного омывания ИсТЬ готовя суспензию 1 х 10 в мл на среде РРМ 1-1640.В ряд центрифужных пробирок вносят по 0,2 мл суспензии гранулоцитов. Затем в часть из них добавляют разные обьемы (0,02 - 0,2 мл) суспензии моноцитов или эритроцитов, содержащих разные количества клеток, В остальные, вместо клеток, вносят среду ВРМВсе пробирки центрифугируют при 200 9 5 мин, надосадочные жидкости удаляют Осадки клеток ресуспендируют в 0,2 мл культуральной среды (КС), Полученными смесями клеток (моноциты и гранулоциты, или эритроциты и гранулоциты, или одни гранулоциты) заполняют капиллярные трубки (по 3 каждой смесью) длиной 1,5 см и диаметром 1,2 .1,4 мм, которые запаяны с одного конца Затем капилляры с клетками помещают открытыми концами в ячейки 96-луночных кругло- донных планшет, в которые предварительно внесено по 0 1 мл КС. Планшеты закрывают крышкой и помещают в термостат при 37 С, 5 -ного СО 100-ной влажности на 24 ч Оценку реакции проводят через 1,3; 6; 12 и 24 ч по количеству клеток, вышедших из капилляров в среду ячейки, путем подсчета в камере Горяева. Показателем интенсивности миграции служит индекс миграции (ИМ), который высчитывают по формуле где К - среднее число клеток, вышедших из 3 капилляров, содержащих гранулоциты с моноцитами или эритроцитами;О - среднее число клеток, вышедших из 3 капилляров, содержащих гранулоциты,Статистическую обработку результатов проводили с помощью критерия Стьюдента,Результаты В процессе отработки предлагаемого метода оценки изменения миграции гранулоцитов под влиянием моноцитов были подобраны оптимальные концентрации взаимодействующих клеток, Гранулоциты были использованы в концентрации 1 х 10 в мл которая согласно лите. ратурным данным является оптимальной в оценке миграции лейкоцитов Индекс миграции (ИМ) одних гранулоцитов из капилляров был принят эа 1, Количество моноцитов, необходимое для выполнения предлагаемого метода, было подобрано экспериментально, Оказалось, что моноциты в концентрации 1 х 10 в мл наиболее выражены (Р0,05) стимулировали миграцию гранулоцитов, Морфологическая оценка 5 10 20 ч 5 30 35 40 45 50 55 кпеок, мигрировавших из капилляров, показала. что 95 97 их являются гранулоцитами, Полученная стимуляция миграции гоанулоцитов под влиянием моноцитов может быть вызвана пассивно, т,е, за счет механического присутствия клеток, Для проверки этого предположения вместо моноцитов к гранулоцитам добавляли эквивалентное количество эритроцитов. Иэ результатов видно, что в отличие от моноцитов эритроциты в используемых концентрациях практически не изменяли миграцию гранулоцитов из капилляров. Следовательно, стимуляция миграции гранулоцитов мо-, ноцитами не была связана с созданием ими механических помех, а обусловлена действием моноцитов,В отличие от общепринятых методов, миграционную активность гранулоцитов оценивали в динамике процесса миграции, что позволило дать оценку кинетике этого процесса. Результаты исследований показали, что уже через 3 ч моноциты значительно (Р0,05) стимулируют миграцию гранулоцитов, достигая максимального уровня через 6 ч, В дальнейшие сроки наблюдения (до 24 ч) ИМ гранулоцитов снижался, но оставался достоверно больше (Р 0,05) ИМ гранулоцитов в отсутствие моноцитов,Полученные результаты показали, что миграция гранулоцитов крови человека модулируется моноцитами в сторону стимуляции. Этот процесс обусловлен активным взаимодействием этих клеток, так как вопервых, миграционная активность гранулоцитов не изменяется под влиянием эритроцитов, и, во-вторых, стимуляция миграции гранулоцитов наступает после определенного времени культивирования взаимодействующих клеток,Таким образом, способность моноцитов стимулировать миграцию гранулоцитов в капиллярном варианте реакции миграции лейкоцитов можно использовать для более полной оценки иммунного статуса, а именно на уровне взаимодействия моноцитов и гранулоцитов, Таким способом можно выявить иммунодефицитные состояния, что позволит проводить целенаправленную иммунокорригирующую терапиюИспользование способа подтверждается примерами.П р и м е р 1, Донор станциии переливания крови При оценке иммунного статуса не выявлено отклонений от нормы (Т-лимфоциты, 1,02 х 10 в мкл; В-лимфоциты 0,3 х 10вв мкл. Сывороточные иммуноглобулины Джи - 12,3 мг;6, М - 1.03 мг, А2,43 мг, Фагоцитоз; фагоцитарный индекс (ФИ)Заказ 3503 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 63, фагоцитарное число (ФЧ) 17, НСТ- тест: спонтанный - 5,7 ф, стимулированный - 32,9). Проведена оценка иммунного статуса на уровне взаимодействия моноцитов с гранулоцитами, Постановка реакции миграции лейкоцитов показала, что в присутствии моноцитов наблюдается стимуляция миграции гранулоцитов (ИМ - 2,74). Полученные данные свидетельствуют о том, что в условиях нормального иммунного статуса у здоровых людей наблюдается стимуляция миграции гранулоцитов под влиянием моноцитов,П р и м е р 2. Больной К. с диагнозом; псориаз. На основании проведенных иммунологических исследований (Т-лимфоциты - 0,65 х 10 в мкл; В-лимфоциты - 0,51 х 10 в мкл. Сывороточные иммуноглобулины: Джи - 24,2 мг, М - 0,87 мг, А - 1,36 мг. Фагоцитоз; ФЧ - 15, ФИ - 60,7. НСТ-тест: спонтанный - 1,4 , стимулированный - 17,2 ф,) выявлено нарушение иммунного статуса. Эти данные недостаточны для полной оценки иммунного статуса, так как не позволяютт оценить его на уровне взаимодействия моноцитов с гранулоцитами, Такие исследования дают возможность более точно выявить иммунодефицитное состояние и назначить целенаправленную иммунокорригирующую терапию, Постановка реакции миграции лейкоцитов у данного больного показала, что в присутствии моноцитов стимуляция миграции гранулоцитов (ИМ - 1,62) снижена на 40,8 посравнениюсданными, полученными в примере 1. Следовательно, выполненные исследования свидетельствуют о иммунодефиците в звене моноцит - гранулоцит у больного К., что указывает на необходимость проведения целенаправленной иммунокорригирующей терапии,П р и м е р 3. Больной 8. с диагнозом: экзема. На основании проведенных иммуннологических исследований (Т-лимфоциты 1,23 х 10 в мкл; В-лимфоциты - 0,29 х 10 в мкл. Сывороточные иммуноглобулины: Джи - 14,7 мг. М - 1,04 мг 0 А - 2,97 мг, Фагоцитоэ: ФЧ - 12,2; ФИ - 53,4. НСТ- тест; спонтанный - 4,8, стимулированный 5 10 15 20 25 30 35 40 45- 40,7 не выявлено изменений иммунного статуса. Для полной его оценки исследовано взаимодействие моноцитов с гранулоцитами в реакции миграции лейкоцитов. Обнаружено, что в присутствии моноцитов наблюдается стимуляция миграции гранулоцитов (ИМ = 4,34), которая на 58,4 выше стимуляции миграции гранулоцитов под влиянием моноцитов, полученной в примере 1, и намного выше данных, полученных в примере 2. На основании этого можно констатировать, что у больного В, при отсутствии нарушений в иммунном статусе, по данным общепризнанной оценки, выявлено иммунодефицитное состояние в звене моноцит - гранулоцит, что указывает на необходимость назначения соответствующей иммунокорригирующей терапии.Таким образом, приведенные клинические примеры показывают, что предлагаемый способ оценки иммунного статуса позволяет более полно обнаружить нарушения в иммунной системе организма, что является важным для проведения иммунокорригирующей терапии.Преимущества предлагаемого способа: 1. Впервые в реакции миграции лейкоцитов показана стимуляция миграции гранулоцитов под влиянием моноцитов.2. Установлен иммунодефицит в системе взаимодействия моноцитов с гранулоцитами у больных с и без вторичного иммунодефицитного состояния.3. Воэможность дать более полную оценку иммунного статуса, что важно в практическом здравоохранении для выявления иммунодефицитных состояний и проведения адекватной иммунокорригирующей терапии,Формула изобретения Способ определения кооперации гранулоцитов и моноцитов путем постановки реакции миграции лейкоцитов в капиллярах в присутствии моноцитов и при повышении миграционной способности определяют стимулирующее влияние моноцитов на гранулоциты.