Способ определения ингибиторов трипсина в сыворотке крови

(ы) з й 01 й 33/сд ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Львовский государственный медицинский институт(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ ТРИПСИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ(57) Способ определения ингибиторов трипсина в сыворотке крови относится к медицине, а именно к клинической лабораторной Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики острых и хронических воспалительных процессов, обусловленных недостаточностью ингибиторов трипсина в сыворотке крови,Цель изобретения - повышение точно-. сти способа.Поставленная цель достигается тем, что в качестве субстрата трипсина используют белок азофибрин, продукты расщепления которого образуют в щелочной среде раствор красного цвета, по интенсивности соответствующий протеолитической активности трипсина, затем добавляют исследуемую сыворотку и по разнице (интенсивности окрашивания) устанавливают уровень ингибиторов трипсина.,5 Л 21675776 А 1 диагностике, и может быть использовано для диагностики острых и хронических воспалительных процессов, обусловленных недостаточностью ингибиторов трипсина в сыворотке крови. Цель - повышение точности. Цель достигается тем, что к 0,5 мл сыворотки крови прибавляют 0,5 мл трипсина (25 мкм), спустя 15 мин - 5 мг сухого аэофибрина, инкубируют 1 ч при 37 С, центрифугируют, затем к, 3 мл супернатанта прибавляют 0,05 мл 10 н, гидроксида натрия и копориметрируют при 500 мл, Расчет активности ингибиторов трипсина производят по калибровочному графику. Предложенный способ позволяет повысить точность в 1.6 раза по сравнению с прототипом. 3 табл. Способ осуществляют следующим образом.иай о Используют следующие материалы и реактивы: плазму или сыворотку крови, раз- (Л бавпенную в 50 раз трис-буфером; азофибрин; трис-буфер (рН,1, 0,05 М): в мерной колбе на 1000 мл растворяют 1,225 г тригид роксиметиламинометана, в 500 мл дистиллированной воды, прибавляют 7,5 мл 10;-ного раствора Са С 2 и доводят дистил- . В лированной водой до метки, рН 8,1 доводят1 н. раствором НС; 1 н. раствор НС готовят из фиксанала; раствор кристаллического трипсина: 5 мг препарата растворяют в 5 мл трис-буфера (матричный раствор), стабилен при +4 ОС в течение 5-6 дней, перед исследованием готовят рабочий раствор разбавлением матричного трис-буфера в 20 раз(1 мл содержит 50 мкг трипсина); 10 н, раствор гидроксида натрия.К 0,5 мл разведенной сыворотки прибавляют 0,5 мл рабочего раствора тригсина(25 мкг), Для образования комплекса трипсин-ингибитор смесь выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре.Добавляют в пробирку 5 мг сухого азофибрина, смешивают и ставят в термостат на 1ч при 37 С, Вынимают изтермостата,добав- ,0ляют 3 мл дистиллированной воды, размешивают и центрифугируют 15 мин при ЗОООоб/мин. Отбирают 3 мл надосадочной жидкости и переносят в другую пробирку, прибавляют 0,05 мл 10 н.гидроксида натрия, 15колориметрируют на ФЭКе при длине волны 500 нм в кювете 5 мм против воды,П р и м е р. Из каждой пробирки отбиракт по 0,5 мл раствора трипсина, прибавляют по 0,5 мл изотонического раствора 20хлорида натрия и по 5 мг азофибрина, перемешивают, ставят в термостат при 37 С на1 ч, затем прибавляют 3 мл дистиллированной воды, перемешивают, центрифугируют15 мин при 3000 об/мин. Отбирают, 3 мл 25надосадочной жидкости, прибавляют 0,05мл 10 н,раствора гидроксида натрия и колориметрируют на ФЭКе гри длине волны500 нм против дистиллированной воды вкювете 5 мм. ЗООптическая плотность пробы, к которойтрипсин реагировал в присутствии сыворот.ки крови, 0,16. По калибровочному графикунаходят, что это соответствует 5,48 мк,трипсина. Таким образом, концентрация 35трипсина, связанная с ингибитором, составляет 25 мкг - 5,48 мкг = 19,52 мкг,Расчет активности ингибиторов трипсина в исследуемой сыворотке производят по калибровочному графику.Калибровочный раствор трипсина приведен в табл,1.Содержание ингибиторов рассчитывают по формуле: 19,5 50 1000 О 5 24000 - 81,33 мкмоль/л,где 1 Я,52 - количество связанного трипсина (1 моль трипсина связывается с 1 моль ингибитсра);50 - разведение сыворотки;24000 - молекулярная масса трипсина;0,5 - количество разведенной сыворотки в пробе.Данные воспооизводимости предлагаемого метода исследования ингибиторов трипсина по исследованию сыворотки крови здоровых лиц приведены в табл.2.Сравнительные даннье содержания ингибиторов трипсина у 32 больных острым панкреатитом, полученные предлагаемым методом и известным, приведены в табл.3.Формула изобретения Способ определения ингибиторов трипсина в сыворотке крови путем добавления субстрата в исследуемую сыворотку, куда предварительно был добавлен трипсин, с последующим измерением оптической плотности, о т л и ч а ю ц и й с я тем, что, с целью повышения точности, в качестве субстрата используют азофибрин, а оптическую плотность измеряют в ьцелочной среде.1675776Таблица 3Составитель Н. ТеренинаРедактор М. Бланар . Техред ММоргентал Корректор О, КундрикЗаказ 2998 Тираж 388ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101