Способ получения ронидазы

СОЮЗ СОВЕТСНИХсбациуаесвжРЕСПУБЛИН бб 534 к9 2 51)5 С ГОСУДАРСТВЕННЫИПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГННТ СССР КОМИТЕТ (ЛНРЫТИ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ И(54) СПОСОБ ПО (57) Изобретени водству фермент даза, применяе. Семенники крупног атого скота ельчение стракция ТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(46) 30.07.91. Бюл. У 28 (71) Всесбюзный научно исследовательский институт текстильно-галан терейной промышленности(56) Авторское свидетельство СССР Р 632703, кл. С.12 Н 9/26, 1977.Авторское свидетельство СССР Р 566875, кл, С 12 И 9/26, 1976. ЛУЧЕНИЯ РОНИДАЗИ е относится к произ ного препарата рони мого в медицинской Изобретение относится к производ=ству ферментных препаратов, применяемых в медицинской практике, а именнок способу получения ронидазы, применяемой при лечении рубцов, контрактури тугоподвижности суставов,при подготовке к кожнопластическим операциям по поводу рубцовых стяжений,при длительно незаживающих ранах.Цель изобретенийупрощение способа, повышение выхода и удельнойактивности препарата,Способ заключается в том чтопосле экстракции измельченных семенников крупного рогатого скота воднымраствором уксусной кислоты при рН4,5 4,7 и температуре 2-40 С в тече .ние 2 4 ч проводят очистку экстракта практике. Целью изобретения являетсяупрощение способа, повышение выходаи удельной активности препарата. Способ осуществляют следующим образом.Семенники крупного рогатого скотаизмельчают, экстрагируют О, 1 н.раствором уксусной кислоты при рН4,5 4,7 и 2 40 С в течение 2 4 ч ватмосфере инертного газа, экстрактотделяют и очищают сорбцией ферментав течение 1 -2 ч. на белой глине, которую берут из расчета 25 50 г на 1 лэкстракта, и десорбцией водой прирН 4,5=4,7, которую берут из расчета10 15 ч. на 1 ч, сорбента, а затемраствор сушат. Выход 7,593 от ис=ходной массы, удельная активность1020"2050 усл.ед./100 мг. обработкойпоследнего белой глиной в количестве 25 50 г на 1 л экстрак та в течение 1-2 ч с последующим отделением осадка белой глины и об работкой его водным раствором уксус" ной кислоты при, рН 4,5 4,7 при массовом соотношении сорбента и раство- ра 1: 1 О 15, а экстракцию фермента проводят в атмосфере инертного газа,Схема технологического процесса получения ронидазы представлена в следующем виде:(0,1 н. СНСООН, жидкий коэЬЬищент1:1 2, рН 4,5 4,7, с=2 40 С, 2 =2 4 чв атмосфере инертного газа)Отделение экстрактаОчистка экстрактаСорбция Фермента на белой глине(25-50 г/л), Ф =1-2 ч, десорбцияфермента раствором уксусной кислоты,рН 4,5-4,7 (10-15 ч, на 1 ч,сорбента),С=О,51 ч 1 О Сушка раствора Выход целевого продукта составля 6 т 7,5 "9 Х от исходной массы сырья,а гиалуронидазная активность 10202050 усл.ед. в 100 мг,Используемые параметры экстракцийвеличина рН раствора уксусной кисюоты 4,5-4,7, температура процессазкстракции 2 400 С и время экстракции2 4 ч, обеспечивают максимальноеИзвлечение Фермента. При рН ниже 4,5йли выше 4,7 в экстракт переходятбалластные белковые вещества, содержащиеся в семенниках, при температу-.ре нине 2 С скорость экстракции вОзначительной степени замедляется идля се осуществления требуется уйе.личивать время процесса экстракцииболее 4 ч, а при температуре вьше40 С начинает происходить прогрессиорующая инактивация Фермента 20 30 35 Процесс экстракции проводят не в воздушной среде, а в атмосфере, ли шенной кислорода, для чего через экстракционную смесь в течение всего периода экстракции пропускают инерт ный газ ( азот, аргон) со скоростью О,2-0,4 л/ч на 1 л экстракта, по скольку именно такая скорость пропус " кания инертного газа обеспечивает полное удаление кислорода. В отсутствие кислорода воздуха процессы окисления Фермента не происходят и реакционноспособные группы в его молеку ле, такие, например, как остатки метионина или цистина, не подвергаются окислению. Тем самым в экстракционной смеси не накапливаются про 55 дукты окисления, не обладающие гиалуронндазной активностью, отделене которых от нативной Формы Фермента является затруднительным и требует введения в технологический процессспециальных методов очистки,В этой связи процесс очисткиэкстракта сводится к простым приемамсорбции и десорбции, занимающим неболее 3 .3,5 ч на каждые 100 л экстракта, При этом в качестве сорбентаиспользуют белую глину, посколькуиспользование других известных сорбентов, например активированногоугля, не позволяет полностью сорбировать фермент и приводит к снижениювыхода целевого продукта,На 1 л экстракта добавляют 2550 г белой глины, поскольку добавление меньшего количества этого сорбента (менее 25 г на 1 л) не позволяетполностью сорбировать фермент нетолько за предусмотренный период коне.такта с экстрактом (12 ч), но и заболее длительный промежуток времени(4-6 ч), а добавление большего количества сорбента (более 50 г/л) неприводит к увеличению выхода фермен 1"та и потому является технологическинецелесообразным. При использовании25 50 г белой глины на 1 л экстрахта время полной сорбции ферментасоставляет 1-. 2 ч и потому увеличениеэтого времени приводит к необоснованному удлинению технологическогопроцесса.Для быстрой (за 0,5 1 .ч) десорбции фермента с поверхности сорбентаиспользуют водный раствор уксуснойкислоты,имеющий рН 4,5-4,7, при-этом количество раствора составляет10 15 мас,ч. на 1 мас.ч, сорбента,При величинах рН ниже 4,5 или выше4,.7, а также при снижении количественного соотношения раствора и сОрбента (менее 10 ч. раствора на 1 ч,сорбента) достичь максимальногоизвлечения фермента не удается дажепри увеличении времени контактараствора с сорбентом (более 2 ч),При увеличении количественного соот-.ношения раствора и сорбента (более15 ч. на 1 ч. сорбента) повышениявыхода фермента не наблкдается.П р и м е р 1. 85 кг замороженных семенников крупного рогатогоскота измельчают дважды на волчке,добавляют 85 л (жидк. коэффициент1; 1) О, 1 н. водного раствора уксусной кислоты, устанавливают рН 4,5,через смесь пропускают газообразныйазот со скоростью 0,2 л/ч на 1 л66534 5 1 О 15 20 25 Способ получения ронидаэы, вкйкю.чающий экстракцию измельченных се .менников крупного рогатого скотаводным раствором уксусной кислотылри рН 4,5 4,7 и температуре 2 40 фСв течение 2 4 ч с последующим отДе .лением экстракта и очисткой целевогопродукта, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью упрощения способа,повышения выхода и удельной активности препарата, экстракцию осуществляют в атмосфере инертного газа, аочистку проводят сорбцией экстрактабелой глиной в количестве 25 в"50 гна 1 л экстракта в течение 12 ч идесорбцией целевого продукта воднымраствором уксусной кислоты при рН45 е.4,7 при массовом соотношениисорбента и раствора 1:10 15. 30 35 40 45 Составитель А.СеменовТехред М.Моргентал Корректор М.Демчик Редактор Н.Киштулинец Заказ 2498 Тираж 365 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 10116смеси и экстракцию проводят при 2 фС и постоянном перемешивании в течение 2 ч, жмых отделяют сепарированием при 3000 об/мини отбрасывают, а к 95 л экстракта добавляют 2,375 кг белой глины из расчета 25 г на 1 л экстракта, смесь перемешивают при 20 фС 1 ч, затем центрифугируют, к осадку добавляют 23,75 л воды, подкисленной уксусной кислотой до рН 4,5 (из расчета 1 О ч. на 1 ч. осадка) смесь перемешивают 0,5 ч, затем центрифугируют и надосадочную жйдкость сушат распылением, Выход поропр" ка 6,375 кг (7,5 Ж от исходной массы сырья), а его гиалуронидазная активность 1020 ед/100 мг.Для измерения активности исполь" зуют метод, основанный на предупреждении образования муцинового сгустка.П р и м е р 2. 85 кг замороженных семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 127,5 л (жидк. коэффициент 1: 1,5) 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты, устанавливают рН 4,6, через смесь пропускают газооб разный аргон со скоростью 0,3 л/ч на 1 л смеси и экстракцию проводят при 21 фС и постоянном перемешивании в те чение 3 ч. Жмых отделяют сепарирова- нием при 3000 об/мин и отбрасывают., а к 119 л экстракта добавляют 4,462 кг белой глины (из расчета 37,5 г/л экстракта), смесь перемешивают при 21 ОС в течение 1,5 ч, за" тем центрифугируют, к осадку добав ляют 55,77 л воды, подкисленной ук- сусной кислотой до рН 4,6 (из расче" а 12,5 ч. на 1 ч, осадка), смесь , еремешивают 45 мин, затем центрифу " гируют и надосадочную жидкость сушат распылением. Выход порошка 7,01 кг (8,25 Х от исходной массы сырья), а его гиалуронидазная активность 1020 усл.ед./100 мг. П р и м е р 3, 85 кг заморожен. ных семенников крупного рогатого ско та измельчают дважды на волчке, до бавляют 170 л (жндк. коэффициент 1:2) 0,1 н. водного раствора уксус " ной кислоты, устанавливают рН 4,7, через смесь пропускают газообразный азот со скоростью 0,4 л/ч на 1 л смеси и экстракцию проводят при 40 С и постоянном перемешивании 4 ч. Жмых отделяют сепарированием при 3000 об/ /мин и отбрасывают, а к 142,5 л экстракта добавляют 7,125 кг белой глины (из расчета 50 г/л экстракта), смесь перемешивают при 22 ОС в течеение 2 ч, затем центрифугируют, к осадку добавляют 106,8 л воды, под кисленной уксусной кислотой до рН 4,7 (из расчета 15 ч. на 1 ч. осадка), смесь перемешивают 1 ч, затем центи" фугируют и надосадочную жидкость сушат распылением. Выход порошка 7,65 кг (97, от исходной массы сырья), а его гиалуронидазная активность 2050 усл.ед./100 мг.Формула изобретения