Способ определения белка в растворе

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ Я ВТОРСКОМУ ДЕТЕЛЬСТВУ белка С по рассчитываюформуле центра ющим обра зом,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА ВРАСТВОРЕ(57) Изобретение относится к биологии, биотехнологии и медицине, может быть использовано в клиниках и применяться дляопределения концентрации белка в автоматизированном режиме при биотехнологических процессах, конкретно для Изобретение относится к биологии, биотехнологии и медицине и может быть использовано при количественном определении белка в биологических жидкостях и на этапах технологических процессов, а именно для солюбилизированных детергентами растворов мембранных белков.Цель изобретения - определение блока в присутствии поверхностно-активных веществ при одновременном повышении точности способа.Способ осуществляют следу Снимают спектр раствора поверхностно-активного вещества (ПАВ) и исследуемого раствора белка в ПАВ в ультрафиолетовом диапазоне длин волн 200 - 260 нм, находят две длины волны, при котором поглощение растворов одинаково и ю) Й 21656458 А 1 солюбилизированных детергентами растворов мембранных белков. Цель изобретения - определение белка в присутствии ПАВ при одновременном повышении точности способа. Сущность способа заключается в том, что предварительно снимают спектры поглощения растворов белка с поверхностно- активным веществом и самого поверхностно-активного вещества при той же концентрации в УФ-диапазоне длин волн 200 - 260 нм, определяют две длины волны, при которых ошибка определения концентрации белка минимальна, и затем рассчитывают концентрацию исследуемого белка. Предлагаемый способ позьоляет проводить определение белка в присутствии ПАВ и повысить точность определения в 6,4 раза. 1 табл. С = (1)х Е 1,2 х А 1,2)где- длина оптического пути;Е 1,2 - разность коэффициентов молярной экстинкции при двух найденных длинах ВОлн (А 1 и А 2);А 1,2 - разность величин поглощения раствора исследуемого белка при длинах вали А 1 и А 2 .П р и м е р, Определялись концентрации четырех белков; бычьего сывороточного альбумина (БСА). человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), цитохрома С лошади и миоглобина кашалота в растворах, содержащих разное количество Эмульгена 913 (до 0,01 ф), неионного детергента, широко используемого для выделения мембранных белков,(белок) Белок Ошибки п и оп еделении кон ент а ии, ,10+ 41 +39 +123 +1 0,04-0,080,4-0,8 0,04-0,15 0,32 - 0,9 БСА 12+ 5 17 ч 6 10+ 5 9+2 12+ 5 11+4 10 +5 3+6 35 7+5 6" 5 7+5 3+3 1 +5 7+3 5.+2 ЧСА Среднее по, БСА и ЧСАЦитрохром 12 4 2 1 +1 Зч 1429+ В27+ 518+ 515+4 0,04 - 0,090.4-0,90,02-0,160,31-0,9 Миоглобин Среднее погемопротеинам 125 22 Спектры поглощения растворов укаэанных белков, белков с Эмульгенам 913 в различных концентрациях и Эмульгена 913 притех же концентрациях регистрировались спомощью спектрофотометра "Оеа 1 етт 5РасМагб НР" (США) в кювете с длинойоптического пути 1 мм в области длин волнот 200 до 260 нм.Поиск длин волн проводился посредством минимизации относительной случайной ошибки определения концентрациибелка по всем парам длин волн в интервале, от 205 до 225 нм и с использованием ЭВМ.Одновременно рассчитывалась концентрация белка по формуле 15С = Ки ЛА,2где К 1,2 = 1/1 х Е 1,2,в которой величина К 1,2 была усреднена по 11белкам, фосфоглюкозоизомеразе, глицерофосфатдегидрогеназе, альдолаэе, триозофосфатизомераэе, фосфоглицераткиназе,лактатдегидрогеназе, алкогольдегидрогеназе, миоглобину, цитохрому С, БСА(все белкифирмы "Яегча", США), ЧСА (Е 1 цса, ФРГ).Рассчитанные концентрации белков 25сравнивали с контрольными концентрациями, определенными гравиметрически. Полученные экспериментальные ошибки еопределении концентрации белков для оптимально подобранных длин волн приведены в таблице, Данные таблицы формулырасчета концентрации белка можно испольэовать с учетом погрешности для любогоисследуемого белка в растворах, содержащих до 0,01 О Эмульгена 913. 35Использование предлагаемого способаопределения концентрации белка в растворах, содержащих неизвестное количествоповерхностно-активного вещества, обеспечивает по сравнению с существующими 40способами следующие преимущества: возможность определять белок е растворах, содержащих ПАВ: возможность более точной количественной оценки концентрации белка (как видно иэ таблицы, при усреднении расчетом концентрации по трем укаэанным формулам, предложенный способ позволяет уменьшить погрешность оценки до 7 ОО, по прототипу - 32 О).В таблице приведены данные, характеризующие определение концентрации белка в присутствии Эмульгена 913.Кроме того, предлагаемый способ сохраняет активные свойства исследуемого белка и не требует использования дорогостоящих реактивов, что уменьшает материальные затраты и увеличивает эффективность использования метода,Формула изобретения Способ определения белка е растворе, включающий измерение поглощения раствора белка в ультрафиолетовой области и расчет концентрации белка с учетом значения коэффициента малярной экстинкции, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью определения белка е присутствии поверхностно-активных веществ при одновременном повышении точности способа, снимают спектр раствора поверхностно-активного вещества в ультрафиолетовой области, находят два значенияиЛ 2 длины волны, при которых поглощение одинаково, и рассчитывают концентрацию белка по формулеС = (1/1 х Е 1,2) х А 12,где 1 - длина оптического пути;Е 1,2 - разность коэффициентов малярной экстинкции при двух найденных длинах волн Я 1 и 4;А 1,2 - разность величин поглощения раствора исследуемого белка при длинах волн А 1 и А 2,1656458 Продолжение таблицы елка;639 (Аидов - А 22- отношение содержания Эмульгена 913 к содержанию- . 1 - расчет предложенным сйособом по формуле С 2 - расчет по формуле С - 0,846 (А 21 О - А 224):3 - расчет по формуле С = 1,113 х(А 212 - А 2 д 4)4 - биуретовым методом (2); 5 - методом Лоури (3) Составитель Н,Гуляе Техред М.Моргентал актор А.Ревин Корректор М,Пож каз 2050ВНИИПИ Гос Тираж 417 Подписноественного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва,.Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101