Способ определения специфической антителсвязывающей активности аллергоида

оюз сон оцидлис РЕСПУБЛ скихических 6455 51)5 " 01 И 33/53 БРЕТ кдклкния спкцифичкс ЗЫВАЮЩКЙ АКТИВНОСТИ(54) СПОСОБ ОПР КОЙ АНТИТКЛСВЯ АЛЛРР ГОИДА (57) Изобретени не и может быть Бюл. Ф 18ский научно-исследоитут вакцин и сывот по зводстве аллергоидов апова, Н.И,ВоронкиА,Камбург88,8) тенин для контроля и стандартизации. Цель соба. Для этого испо связывания антителсп е В, А 3 лппа 11 егдепя- АХ 1 егду,-416,К., Уее аЬ зобе й ВЙБ 1. р.р. 40 воротки (классов С и ванным аллергоидом в 1,0:(0,5-.0.7) мл, При ра иммунной сыворотки исходного по данным р мой гемагглютинации у наличие у депонирован да специфической акти Изобретение оможет быть исп осится к медицине зовано в прои сте- танов из пыльцыих качества водстве аллергоидний для контролядартизации,Цель изобретенности способа опрческой активностиаллергоида эа счевыявления степеш ие тоцифиногоного ия - повышееделения сп депонирова одноврем связывани нообулин Спосо ующим обествляют сл разо отовя постановки реакцииенты;Депонированный алле орма, аллергенного вляющего собой вэв ингре го 1товаяепарат ь сорб редст ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(21 ) 4180099/28 ( 22) 13,01.87 (46) 15,05.90. (71) Ставрополь вательский инст роток(72) И.А,Кривол Б.Н.Райкис и 0 (53). 615.373 ( (56) Роц 1 яеп Ь п 3.цш ЬудгохЫе изей п шоЖГх 1985, 40, У 6,сится к медициьзовано в произ пыпьцы раскачества и - упрощение спо ьзуют реакцию цифической сы- М) с депониросоотношении снижении титв 4-512 раз от еакции непрястанавливают ного аллергоивности,рованного на Ь-тирозине формалинизированного аллергена, который передработой тщательно взбалтывают.2, Контрольный образец . в . взвесь Ь-тирозина, не содержащая антиген. В пробирку вносят 3 мл фосфатного буферного раствора рН - 7,0, добавляют 1,25 мл 247-ного раствора Ь ти, розина в 3,8 Б растворе НС 1 и 1,25 мп 3,2 Б раствора ИаОН. Устанавливают рН взвеси 5,0 - 6,0, перемешивают и выдерживают 2 ч при +4 С. Затем взвесь юсеф центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 мин надосадок удаляют а осадок дважды отмывают 5 мл фосфатного буфера, рН 5,5 - 6,0, После промывки осадок ресуспендируют 5 мл этого же буфера для последующего ис 1564552пользования в качестйе контрольногообразца,3. Специйическая иммунная сыворотка, которую получают от больных,5страдающих поллинозом, вызванным данным видом пыльцы (амброзии, ежи ит.д,), или путем иммунизации кроликов породы Шиншилла пыльцой того жевида растения по следующей схеме:первую инъекцию - 57.-ную взвесь пыльцы, например, амброзии в полномадъюванте Фрейнда вводят по 0,6 млподкожно и 0,6 мл внутримышечнокаждому кролику и далее с интервалом7 дней делают вторую и третью инъекции в таких .же дозах, как .и первую,На 14-й день после третьей инъекцииделают пробный забор крови из ушнойвены для определения титра в РНГА,При получении титра 1:640 проводяттотальное кровопускание. Б случае,если после 1 цикла иммунизации титры гемагглютинирующих антител окажутся ниже,чем 1:640, цикл иммунизации повторяют через 45 дней, послетретьей инъекции,При получении, сывороток. с титром1:640 - 1:10240 их разливают в ампулы по 1 мл и лиойилизируют по известному режиму для сывороточных препаратов, Перед употреблением сыворотку в каждой ампуле разводят в 1 млдистиллированной воды, Как.сьворотка пациента, так и разведенная кроличья сыворотка, используемые в данном способе, должны иметь титр вРНГА 1:320 и вышее,Специфическую антителосвязывающуюактивность депонированного аллергоида определяют следующим образом:берут 2 пробирки, в одну из которыхвносят 1 мп депонированного аллергоида, а в другую - 1 мл контрольногообразца, Испытуемую и контрольнуюпробирки центрифугируют в течение15 мин при 2000 об/мин, после чегонадосадочную жидкость сливаот, а косадкам в обе пробирки добавляют по0,5-0,7 мл соответствующей специфи.ческой сыворотки, перемешивают и оставляют на 18 ч при комнатной температуре для связывания антител, По, истечении времени инкубации пробиркицентрифугируют 15 мин при 2000 об/мин,надосадочную сыворо.ку с каждого об-.разца сливают и определяют в каждомиз них титр антител в РНГА, Параллельно определяют в РНГА титр антител в исходной специфической сыворотке, не подвергнутой инкубации,Учетным считают титр антител втой лунке каждого ряда, где ещеопределяется гемагглютинация наиОпределив титры антител в исходной сыворотке, сьворотке, инкубированной с контрольным образцом, и сыворотке, инкубированной с депонированным аллергоидом, сопоставляют полученные результаты. При этом титрсьворотки, инкубированной с контрольным образцом, должен совпадать с титром исходной сыворотки, что является доказательством отсутствия неспецийической сорбции антител на депонаторе Ь-тирозине (допускается снижение титра сыворотки, инкубированной с контрольным образцом, в 2 разаот исходного,.что может быть погрешностью РНГА), Далее сопоставляютс титром исходной сьворотки титр сыворотки, инкубированной с опытнымобразцом-депонированным аллергоидом,При этом если депонированный аллергоид обладает специфической активностью, то происходит одновременноесвязывание его с гемагглютинирующими антителами, представленными 1 яЬи 1 дМ, что выражается снижением титра сыворотки в опыте в 4-52 раз вРНГА,П р и м е р 1. В опытную пробиркувносят 1 мл сорбированного на Ь-тирозине аллергоида из пыльцы амброзии,а в. контрольную пробирку - 1 мл контрольного образца взвеси Ь-тирозина,не содержащей антигена амброзии. Пробирки центрийугируют 15 мин при2000 об/мин, затем надосадочную жидкость сливают, а к осадкам в обе пробирки добавляют по 0,5 мл специфической к пыльце амброзии гипериммунной кроличьей сыворотки, содержимоепробирок перемешивают и инкубируютпри комнатной температуре в течение18.ч. Затем пробирки центрифугируют15 мин при 2000 об/мин, надосадочнуюсьворотку с образцов сливают и определяют титр гемагглютинирующих антител в РНГА, Параллельно ставят РНГАс исходной неинкубированной сывороткой, При этом получают титр сыворотки, инкубированной с контрольным образцом, равный 1:1280, титр исходной неинкубированной сыворотки -1:1280, титр сыворотки, инкубирован1564552 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Составитель Н,Калинин Техред Л,Олийнык Корректор Л.Бескид Редактор М.Циткина Тираж 508 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Заказ 1157 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул.Гагарина, 101 ной с делонированным аллергоидом амброзии, - 1:320, Показатель снижения титра антител - 4 раза при отсутствии неспецифической сорбции антител на сорбенте. Способность испытуемой серии сорбированного на Ь-тирозине аллергоида из пыльцы амброзии связывается со специфическими противоамброзийными гемагглютинирующими антителами, представленными иммуноглобулинами не менее чем двух классов (Ь,М), свидетельствует о наличии специфической активности представленных в препарате антигенных дегерминант, следовательно, данная серия препарата может быть выпущена для лечения амброзийного полиноза,П р и м е р 2. Способ определения специфической активности депонированного аллергоида ведут так же, как в примере 1, за исключением того, что берут сорбированный на Ь - тирозине аллергоид из пыльцы ежи сборной (другого вида растения) и соответствующую специфическую к пыльце ежи гипериммунную кроличью сыворотку, При этом получают титр сыворотки, инкубированной с контрольным ббразцом, 1:10240, титр исходной неинкубированной сыворотки - 1:10240, титр сыворотки, инкубированной с опытным образцом, - 1;20, Показатель снижения титра 512 раз, Исследуемая серия препарата обладает выраженной специфической активностью и может быть выпущена для лечения поллиноза, вызванного пыльцой ежи сборной,П р и м е р 3. Способ определения специфической антителсвязывающей активности депонированного аллергоида ведут так же, как в примере 1, за исключением того, что используют другую серию сорбированного .на Ь-тирозине аллергоида из пыльцы амброзии. При этом получают: титр сыворотки, инкубированной с контрольным образцом, 1:280, титр исходной неинкубированной сыворотки - 1:1280, титр ,сыворотки, инкубированной с опытным образцом, - 1: 1280. Снижение титране произошло, следовательно, при изготовлении данной серии сорбированного на Ь-тирозине аллергоида из пыльцы амброзии имело место нарушениетехнологического режима, приведшеек инактивации специфических антигенных детерминант аллергоида и препарат утратил специфическую активность,Данная серия препарата не можетбыть выпущена для использования сцелью специфической гипосенсибилизирующей терапии амброзийного поллиноза.Использование предлагаемого способа по сравнению с прототипом позволяет определить специфическую антителснязывающую активность депонированного аллергоида одновременно поотношению к антителам, принадлежащим к иммуноглобулинам не менее чемдвух, классов (18 М, 18 Ь), чтопозволяет значительно повыситьточность способа определения специФической активности депонированногоаллергоида и сократить время исследования до 1 сут,Формула изобретенияСпособ определения специфическойантителсвязывающей активности аллергоида путем добавления специфическойсыворотки к аллергоиду и последующей оценки реакции, о т л и -ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения точности способа за счетодновременного выявления степени связывания 186 и 18 М,используют диализованный формальдегидобработанныйаллерген-аллергон,сорбированный наЬ-тирозине, добавляют специфическуюсыворотку с титром 1:320 - 10240,при соотношении с депонированнымаллергоидом 0,5-0,7;1, оценку осуществляют в реакции непрямой гемагглютинации и при снижении титра сыворотки в 4-512 раз определяют наличие специфической антителсвязывающейактивности,