Способ диагностики диабетической микроангиопатии

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК С 01 И 33/68 ОБРЕТЕН ТВУ в,а ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И СКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТ(56) Гфимов А.С. Диабетические ангиопатии. Киев: Здоровье, 1973. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ МИКРОАНГИОПАТИИ(57) Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики ангиопатий, и может быть использовано при дифференциальной диагностике диабетических микроангиопатий,Цель изобретения - повышение точности диагностики. При подозрении на диабетическую микроангиопатию у больного производят забор крови из вены в количестве 5 мл, отделяют сыворотку, помещают ее в целлофановый мешок и Изобретение относится к медицине,а именно к способам диагностики ангиопатий, и может быть использованопри дифференциальной диагностике диабетических микроангиопатий,Целью изобретения является ловышение точности диагностики.Способ осуществляют следующим образом.При подозрении на диабетическуюмикроангиопатию у пациента производят забор крови из локтевой вены на 801564553 2диализируют, помещая мешок в буферный раствор (0,001 М КНРО, - КОН, рН 6,5). Время диализа 3 сут (первые сутки - при комнатной темпера- туре, вторые и третьи - при 4 С). В результате эуглобулины выпадают в осадок, который отделяют центрифугированием, отмывают фосфатным буфером и растворяют н 0,5 мл 0,15 М Иа НРОх х 2 НО-КНР 04 -ИаС 1 при рН 7,2, С частью раствора эуглобулинов проводят качественную реакцию на присутствие в их составе альфа-гаптоглобина, используя моноспецид ическую антисыворотку против альфа-гаптоглобина. С этой целью используют иммуноэлектрофорез,реакцию иммунопреципитации в агаре по Оухтерлони или метод двойной радиальной иммунодиффузии по Манчини, В случае обнаружения в эуглобулинах альфа-гаптоглобина ставится диагноз: диабетическая микроангиопатия. Метод обладает высокой специфичностью. 2 табл. тощак в количестве 5 мл. Кровь помещают в сухую чистую пробирку,инкубируют при 37 С 15 мин в термостате,а затем в холодильнике при 4 С еще115 мин, Образовавшийся сгустоккрови отделяют от стенок пробиркитонкой стеклянной палочкой и кровьцентрифугируют в течение 20 мин при1500 об/мин. После центрифугированияотделившуь 1 ся сыворотку собирают вцеллофановый диализный мешок, который помещают для диализа в буферныйраствор с низкой ионной силой 0,001 М КНРО 4 -КОН (рН 6,5). Объем диализирующего раствора 400-800 мл. Время диализа 3 сут (первые сутки при комнатной температуре, вторые и третьи - при 4 С в холодильнике). В результате этого эуглобулины сыворотки крови выпадают в осадок, который собирают после центриАугирования про О бы при комнатной температуре в течение 20 мин при 1500 об/мин,а .осадок эуглобулинов трижды отмывают фосфатным буфером описанного состава путем взбалтывания осадка в буфере и последующего центрифугирования. Отмытый осадок растворяют в буферном Физиологическом растворе 0,15 М Иа,ъНРОх 2 НО - КН РО . - ИаС 1 (рН 7,2) в объеме 0,5 мл. Нерастворенную часть осадка удаляют центрифугированием, С растворимой частью эуглобулинов проводят качественную реакцию на наличие альфа-гаптоглобина, С этой целью используют иммуноэлектро-. 25 форез с применением моноспециАической антисыворотки против альфа-гаптоглобина человека (например,Аирмы "Севак, ЧССР). Электрофоретическое разделение белков эуглобулиновой фракции проводят в 1 геле агара, приготовленном на барбиталовом буфере (рН 8,6, (Ц 0,05) следующего состава: 10,3 г веронала натрия (мединала) + 185 г веронала в 500 мл дистиллированной воды, в аппарате для электрофореза агар - гель, В качест,ве электронного буфера используютбарбиталовый буфер (рН 8,6, Р 0,085) следующего состава: 10,3 г веронала 40натрия (мединала) + 1,85 г вероналав 1000 мп дистиллированной воды,После окончания электрофореза в траншею для антисыворотки заливают моноспецифическую сыворотку к альфа -гаптоглобину и пластины с агаром инкубируют в течение 24 ч во влажной камере для прохождения реакции иммунопреципитации, которая проявляетсяв виде характерной дуги преципитации. 5 О Окраску иммуноэлектрофореграмм осуществляют 0,25 .-ным раствором кумаси В,. приготовленным на смеси мета. нол - дистиллированная вода - ледяная уксусная кислота в соотношении 5:5:1, Другими способами идентификации альфа-гаптоглобина в составе сывороточных эуглобулинов являютсяреакция иммунопреципитации в агаре по Оухтерлони или метод двойной радиальной иммунодийфузии по Манчинис применением готовых коммерческихмоноспецифических антисывороток против альфа-гаптоглобина человека,В случае обнаружения в эуглобулинах альАа-гаптоглобина ставитсядиагноз: диабетическая микроангиопатия.П р и м е р 1, Пациент К мужчина, 30 лет.Диагноз: сахарный диабет инсулинзависимый (1 тип) тяжелой Формы всостоянии компенсации (колебания суточной гликемии не более 8-9 ммоль/ллпри аглюкозурии).Из сыворотки крови данного больного выделяли эуглобулиновую Арак-цию, отмывали,ее фосАатным буфером0,001 М (рН 6,5), а затем растворяли в 0,15 М фосйатном Физиологическом буферном растворе описанногосостава, Полученный раствор сыворо"точных эуглобулинов подвергали иммуноэлектрофоретическому анализу, Вкачестве преципитирующей антисыворотки использования коммерческую моноспецифическую сыворотку против альфа -гаптоглобина человека ("Севак",ЧССР). На иммуноэлектрофореграммевыявляется четкая дуга преципитациив области альфа-глобулинов, что указывает на наличие альфа-гаптоглобина в составе белков эуглобулиновойфракции. Поставлен диагноз: диабетическая микроангиопатия,Для верификации поставленного диагноза у этого больного проводиликапилляроскопию и капиллярограйиюногтевого ложа пальцев ног и определяли сосудистую проницаемость, а также обследовали сосуды глаз с помощьюбиомикроскопии конъюктивы, прямой иобратной офтальмоскопии глазного днас расширенным зрачком, Поражения сосудов почек диагностировали на осно-,вании.исследования мочевого осадка.путем подсчета форменных элементовв трехчасовой и суточной порциях мочи и суточной протеинурии,В результате обследования быпподтвержден поставленный диагноз:диабетическая микроангиопатия 11 -111 ст, Это подтверждает высокуюспецифичность способа,П р и м е р 2, Пациент М мужчина, 46 лет.5 5 б 45Поступил с диагнозом: ишемическаяболезнь сердца; стенокардия напряжения и покоя 111-1 Ч функциональныйкласс. Атеросклероз венечных арте 5рий, НКО. Облитерирующий атеросклероз сосудов нижних конечностей,Диагноз верифицирован клиническими, биохимическими и инструментальными методами, включающими электрокардиограмму, велоэргометрию,селективную коронароангиографию,Больной предъявлял жалобы на чувство жажды, сухость во рту, зуд. Всвязи с этим был проведен анализ науровень гликемии и глюкозурии. У боль"ного было выявлено повышение содержания.глюкозы в крови натощак и появление глюкозы в суточной порциимочи. На основании этого был поставлен диагноз: сахарный диабет легкойформы, впервые выявленный.Поскольку у данного больного наблюдались выраженные сосудистые поражения, возникла необходимость дифференциальной диагностики ангиопатийс целью выбора адекватной тактикилечения, Для этого пациент был обследован по предлагаемому способу, Врезультате исследования альфа;гаптоглобин в составе эуглобулиновойфракции сыворотки крови не был обнаружен, что свидетельствует о том,что сосудистая патология у данногобольного не диабетогенного.характера, Для верификации заявляемого способа больному проводили дополнительно исследования с помощью широкоиспользуемых способов диагностикидиабетических микроангиопатий, в результате которых не было выявленоспецифических изменений, характерньмдля сахарного диабета, в сосудахмикроциркуляции различной локализации, в частности в сосудах глаз и почек.Данный пример указывает на то,что при применении предлагаемогоспособа создается возможность строгодифференцированного подхода в диагностике ангиопатий у больных сахарным диабетом,П р и м е р 3. Пациент Т., мужчина, 55 лет,Диагноз: сахарный диабет среднейтяжести в состоянии компенсации.Длительность болезни 6 мес.Во время пребывания в стационаребыл обследован на предмет наличия ангиопатий с помощью капилляроскопииногтевого ложа пальцев ног,определения сосудистой проницаемости,проведения биомикроскопии коныонктивы,оф-тальмоскопии глазного дна,исследования мочевого осадка. На основанииданных исследований не было выявлено патологических изменений в сосудах. Параллельно с проведением названного комплекса обследования у данного больного определяли наличиеальфа-гаптоглобина в эуглобулиновой фракции по заявленному способу.Реакция на альфао-гаптоглобин положительная,Через 8 мес от момента обследования этот же больной повторно попалв отделение для стационарного лечения, где при клиническом осмотре былпоставлен диагноз: сахарный диабетсредне-тяжелой формы, лабильное течение, При осмотре окулистом имеломесто равномерное расширение век смножественными микроаневризмами,располагающимися по ходу верхнего инижнего темпорального сосудистогопучка, парамакулярно, Сделано заключение: диабетическая ангиопатиясетчатки, 1 стадия,Таким образом, данный клиническийпример свидетельствует о том, чтоальфа -гаптоглобин образуется настадии заболевания, когда микроангиопатия еще не поддается диагностике, т.е. на самых ранних этапах ихобразования. Следовательно, появление альфа-гаптоглобина в эуглобулиновой фракпщи сыворотки крови является одним из первых признаков формирующейся диабетической микроангиопатии.В табл, представлены данные поопределению альфа-гаптаглобина всоставе эуглобулинов при различныхсосудистых заболеваниях, в табл,2 -уровень сывороточных эуглобулинови качественный анализ на содержаниев их составе альфа-гаптоглобина,Предлагаемый способ обладает высокой специфичностью, посколькуальфа-гаптоглобин, как видно изтабл. и следует из приведенных примеров, обнаруживается в составе эуглобулинов только при ангиопатиидиабетогенного характера.Предлагаемый способ имеет сущест-,венные преимущества перед лрототипом, Как видно из табл.2, само по1564553 Таблица Количество исследований с отрицательной реакцией наФ гаптоглобин Количество исследований сположительнойреакциейна М-гаптоглобин Общееколичество исследований Исследуемая группа лиц О 47 48 62 62 О 16 16 О О 23 О себе повыаение количества эуглобу-.линов в сыворотке крови не можетбыть надежным критерием для постановки диагноза диабетическая микроангиопатия,Таким образом, предлагаемый способ обладает высокой специфичностью при диагностике диабетических микро,ангиопатий. Здоровые доноры . 11 Больные сахарным диабетомбез признаковпоражения сосудовБольные сахар" ным диабетомс наличием микроангиопатий,Больные атеросклерозом безпризнаков сахарного диабетаБольные гло- мерулонефритом 6 Больные тромбофлебитом 6 Больные тирео.токсикозом 23ь Формула изобретенияСпособ диагностики диабетической микроангиопатии путем клинико-лабораторного обследования, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повьппе,ния точности диагностики, проводят качественное определение альфа-гаптоглобина в сыворотке крови и при наличии последнего диагностируют диабетическую мнкроангиопатию,О 1564553 Т а б л и ц а 2 Количество исследований Исследуемаягруппа лиц Количество белка в эуглобулинах сыворотки крови, г(л (М+щ) Здоровые донорыБольные са 6, 36+0,22 харным диабетом без 47 1 О, 26+, 09 харным диабетом с мик 16,43+4;42 + 18 14,8 "3, 111,02+1,8 12 12 росклерозомТираж 508 Подписное Заказ 1157 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 13035, Москвй, Ж, Раушская наб., д, 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 признаковпоражениясосудовБольные сароангиопатиямиБольные гломерулонефритомБольные атеНаличие (+)или отсутствие (-)альфа-гаптоглобина вэуглобулинах