Способ определения эмбриотропного действия микробных препаратов

(56)токси1687 10 нцент 1ОпредеВодить виз самыхла всех и од з чисние овышение егко доступен для Учет снижения р Для осуществ мо соблюдать Необходимо и леток селезенки с ан-комплемент не леток селез ообразования омплемент" розеткообраоле, что не верных отлиэмбрионов от при наличии разниЗОЕ и более присодержания 1 НК в ижениии бообязат тимус ьчом а 4 ыте и контр явить досто ной группы зования в о позволяет в лее, посктропногообязательноли одноврем наличии экробного олькуЭАфект рио епа чий контроль опытной.Необходим розеткообраз комплемент" яются оба показат зм енно,существляется сле ИМ пособ озом.еременных саподвергают о использов ования реак ь в пеакци в "зимозан б к белых беспогаляциоыномупрепарата,в концентра и проведениными маркепитами, был леток. скольк дных Б крысадекватоэритр реакции озами, напртмечен ли е денс твипример микробногонтоморАпна,аркерных с х ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР 14422261/28-1424.05.8830.04.90, Бюл, Р 16Рижский медицинский институтЛ.Н.Калинина, И,М.Ремез,екслер и М.Е.Иващенко576.8.093.1 (088.8)Методические рекомендации поГ,кометрии. М,: Секретариат СЭВс. 122-150.(57) Изобретение относится к медицне, а именно к токсикологии, Цель Изобретение относится к областимедицины, а именно к токсикологии. Целью изобретения является ускореточности способа.ения способа необхояд условий.пользовать взвесьпоскольку клетки тимуса в реакции розет с препаратом "зимозандают низкие показатели изооретенияускорение и повышениеточности способа. Проводят исследование содержания розеткообразующихклеток селезенки плода с препаратом"зимозан-комплемент , определяютсодержание ПНК в тимусе плода. Эмбриотропное действие определяют поснижению розеткообразования клетокселезенки плода с препаратом "зимазан-комплемент" с одновременным снижением содержания ДНК в тимусе. Использование изобретения позволит выявить эмбриотропное действие микробных препаратов на уровне пороговыхкораций. ление ДНК необходим тимусе, поскольку э крупных по величине мунокомпетентных органов,выделенияозеткообразования реактивом "зимообходимо проводить цы с контролем на1,0 + 0,21; 4,0 + 0,36;,8,0 + 0,35 0,0 + 1,58 мг/м, производят кесарево сечение на 21-й день беременнос 1 и с соблюдением правила поочередного вскрытия животных из разных групп, Селезенку продавливают через капроновую сетку с отверстиями 60 мк в пробирку, в которую затем добавляют 0,3 мл забуференного физиологического раствора. Доводят концентрацию взвеси клеток до 2 10 кл/мл. К 0,1 млбакой взвеси клеток селезенки добавляют 0,1 мл 0,27 взвеси реактивазимозан-комплемент" на забуференном изиологическом растворе. Зимозаномплемент" готовят ех ешроге путем оединения жидкого комплемента морсой свинки с зимозановыми зернами-отечение 30 мин при 37 С. Взвесь леток сзимозан-комплементомо нкубируют в термостате при 37 С в ечение 10 мин, затем пробирку центифугируют 5 мин при 100 я, Далееойнкубируют взвесь при 4 С 60 мин.1 атем клетки взвеси фиксируют 0,1 мл 6,6 глютарового альдегида. Через 5 мин взвесь промывают забуференным физиологическим раствором и делают тонкие мазки на обезжиренных предметных стеклах, Иазки высушивают на Воздухе, фиксируют 3 мин метанолом, Красят азур-эозином в течение 10 мин, Оценивают процент розеткообразующих лимфоцитов от общего числа мононуклеаров, подсчитав 200 клеток. Находят процент снижения розеткообразующих лимфоцитов в опыте по сравнению с контролем, принимая контроль за 100 7Для рпределения содержания ДНК тимусы гомогенизируют при 4 С, осаж 0 дают нуклеиновые кислоты из гомоГенатов НС 10 при 4 С, осадок центрифугируют при 4 С при 4000-5000 я 10 мин; Охлаждение необходимо для йредотвращения энзиматической и киспотной деструкции нуклеиновых кислот. Осадок отмывают НС 10, спиртом, смесью спирта с эфиром для удаления кислоты, липидов, пимн. ДНК Выделяют в виде осадка при гидролиэе смеси нуклеиновых кислот ИаОН. Выдерживают 1 ч на водяной бане при 80 С, охлажцают, нейтрализуют при 4 С НС 10 Осадок ДНК отделяют на центрифуге с охлаждением в течение 10 мин при 3000 я и гидролизуют НС 1 в течение 1 ч при 100 С, В гидроли,затах определяют оптическую плотность при 270, 290 нм. По данным спектрофотометрических измерений проводят расчет содержания ДНК по формуле:С мкг ДНК = 0-- х 10 3Л 170 ЛЯ 900,19 где 0,19 - поглощение 1 мкг фосфорануклеиновых кислот, содерщихся в 1 мл раствора;10,3 - средний пересчетный коэффициент для пересчета ко 15 личества нуклеинового фосфора на количество нуклеиновых кислот.Находят процент снижения ДНК в тимусе эмбрионов в опыте по сравнениюс контролем, принимая контроль за100 7,.При наличии разницы розеткообразо- .вания в селезенке на 307 и более исодержания ДНК в тимусе на 407. и бо 25 лее у эмбрионов экспериментальныхгрупп по сравнению с эмбрионами контрольных крыс определяем эмбриотропное действие,П р и м е р. При ингаляционномвоздействии энтомофторина в концентрации 4,0 + 0,36 мг/м на беременныхсамок средний показатель розеткообразования клеток селезенки эмбрионовс препаратом "зимозан-комплемент"составляет 20,6 + 1,347, средний показатель содержания ДНК в тимусе7,92 + 0,34 мг/г свежей ткани. Уконтрольной группы эмбрионов среднийпоказатель содержания розеткообразую 40 щих клеток селезенки с препаратом"зимозан-комплемент" 29,44 + 1,347,средний показатель содержания ДНКв тимусе 13,2 + 0,6 мг/г свежей ткани, Показатель содержания розетко 45 образующих клеток еелезенки у контрольных эмбрионов принимают за 1007.,разница, между опытом и контролем .29,44 - 20,6 = 8,84, что в процентахот контроля 30,07. Показатель содержания ДНК в тимусе контрольныхэмбрионов принимают за 1007., разница между опытом и контролем 13,2 -7,92 = 5,28 мг/г, что в процентахот контроля - 40,07Проведено исследование 140 эмбрио 55нов при оценке эмбриотропного действия 3 микробных препаратовПодтверждением эмбриотропного действия явились: снижение розеткообразованияСоставитель Е.Ярных Техред М.Дидык Корректор Л.Патай Редактор О,Спесивых Заказ 976 Тираж 508 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям н открытиям прн ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 5 15610 в селезенке на ЗОБ и более и содержания ДНК в тимусе на 407, и более в экспериментальных группах эмбрионов крыс, подвергавшихся в период бере менности воздействию микробного препарата на уровне пороговой концентрации, по сравнению с параллельным контролем.Использование изобретения позволит достоверно и объективно выявить эмбриотропное действие микробных препаратов на уровне пороговых концентраций в течение двух дней исследования, в то время как известный способ 15 требует изучения 76 показателей в постнатальном периоде развития потомства в динамике до двухмесячного возраста. Зб 6Формула изобретения Способ определения эмбриотропного действия микробных препаратов путем затравки крыс в. период беременности с последующим извлечением живого плода на 21 день беременности, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа, исследуют розеткообразующие клетки селезенки плода с препаратом "эимоэан-комплемент", затем определяют содержание ДНК в тимусе плода и при уменьшении розеткообразующих клеток селезенки на 307 и более и с одновременным уменьшением содержанияДНК в тимусе на 402 и более определяют эмбрнотропное действие.