Способ определения содержания нативной формы ферредоксина в его препаратах

. СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 9) 94 О 27 8 ОМИТЕТ СССРИЙ И ОТКРЫТИЙ ОСУДАРСТВЕННЫИ О ДЕЛАМ ИЗОБРЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯКузнецо Е.Н.Мух й ил Е(71) Институт биохимии им.А.М.Баха и Институт почвоведения и фотосинтеза АН СССР(56) Гинс В.К. и др. Светозависимое восстановление НАДф в хлоропластах и активность гликолактоксидаэы у яровых пшениц разной продуктивности в онтогенезе. - физиология растений, 1985, т.32, вып.1, с.53-59.Гейровский Я., Кута Я. Основы полярографии. - М.: Мир; 1965, с.474.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ НАТИВНОИ ФОРМЫ фЕРРЕДОКСИНА В ЕГО ПРЕПАРАТАХ(57) Изобретение относится к области биоэлектрохимии. Цель изобретения - упрощение процесса, улучшение воспроизводимости и сравнимости ре зультатов. Цель достигается тем,что снимают циклические вольт-амперные кривые на золотом электроде,модифицированном ди-(4-пиридил)-дисульфидом, при начальном потенциале (-0,4 - (-0,1)В, потенциале точки поворота (-0,78) - (-0,80)В и скорости развертки потенциала 016-0,5 В/с. Концентрация ферредоксина (1,93,8)О моль/л. 1 э.п. ф-лы,1 2 табл.Изобретение относится к области биоэлектрохимии, касается способа идентификации йативного состояния ферредоксина электрохимическим мето 5 дом и может быть использовано для исследований в бисдимии, Физиологии растений, молекулярной биологии для анализа содержания в гомогенных препаратах ферредоксина нативной Формы и его способности участвовать в реакциях, связанных с переносом электронов, включая Фотовосстановление НАДФ , Фиксацию азота и углекислоты.Цель изобретения - упрощение анализа и улучшение его воспроизводимости.На чертеже представлены вольтамперограммы 0,31 мМ свежевыделенного ферредоксина и электролита на золотом 20 модифицированном (кривые 12 и 1 ,2 соответственно) и немодифицированном (кривая 3) электроде.Способ осуществляют в несколько стадий: модификация золотого элект рода, проведение электрохимическОй реакции и регистрация вольт-амперной кривой, анализ вольт-амперной кривой и расчет числа переносимых электронов на молекулу Ферредоксина.Модификацию золотого электрода про. водят путем покрытия поверхности пленкой необратимо адсорбированного мостикового переносчика ди-(4-пиридил)-дисульфида, Необходимо исполь 35 зовать высокоочищенный препарат модииникатора, например, Фирмы Машалектрохимическую реакцию Ферредоксина. и снятие вольтамперограммы проводят в области потенциалов (-0,4) 40(-0,78)В.Модифицирующее покрытие стабильно в области рН 78,2, которая рекомендована для проведенияэлектрохимической реакции Ферредоксина (Ферре 45 доксин в этой области рН проявляет максимальную активность в реакции фотовосстановления НАДФ ).Следующая стадия - проведение электрохимической реакции и снятие вольт-амперной кривой,Обратимый электродный процесс с диффузионным ограничением для стационарного электрода описывается уравнением ы 2 , И 121 = 0,272 п Р 7 1 С, (1) где 1 - пиковое значение тока, А;и - число переносимых. электронов; с 1 - площадь электрода, смР, Б - коэффициент диффузии, равныйдля Ферредоксина 1,2 хх О см/с;Ч - скорость развертки потенциала, В/с;С - концентрация белка, мМ.Электрохимическую реакцию Ферредоксина и Фиксирование вольтамперограммы рекомендуется проводить в следующем оптимальном режиме: кон.центрация Ферредоксина 0,20,4 мМ; рН 8,0;ионная сила 0,10,17 м; скорость развертки потенциала 0,25 В/с; начальный потенциал (-0,1)(-0,4)В Делают также контрольные измерения: получают вольт-амперную кривую Ферредоксина на немодифицированном золо. том электроде и электролита на модифицированном .электроде.Так как при первом сканировании волна восстановления Ферредоксина накладывается на ток восстановления ди-(4-пиридил)-дисульфида, начало волны ферредоксина не всегда хорошо выражено, По вольтамперограмме второго сканирования измерения могут быть сделаны точнее, так как реакция восстановления модифкатора необратима и при повторном сканировании не обнаруживается. Поэтому рекомендует, ся делать два последующих сканирования потенциала, только потенциал точки поворота прямоугольной развертки не должен превьппать (-0,78) (-0,8)Б (относительно насыщенного каломельного электрода).При электрохимическом анализе мо 1 гут мешать электрохимически активные низкомолекулярные соединения, которые искажают вид полярограммы, напри- мер сульфид разложенного кластера. Исследуемый раствор ферредоксина.до анализа необходимо очистить гель-. фильтрацией на сефадексе Сили диализом. Следующая стадия - анализ вольтамперной кривой.Сначала по вольт-амперной кривой. идентифицируют Ферредоксин. Для этого находят редокс-потенциал реакции и сравнивают его со стандартным известным редокс-потенциалом, Потенциал катодного пика обратимого процесса смещен относительно редокс-потенциала на 29 мБ, потенциал анодного пика также смещен в противоположнуюсторону, Разность потенциалов междукатодным и анодным пиками характеризует обратимость процесса. Для обратимого процесса она равна 58 мБ. Длякваэиобратимой электрохимической реакции ферредоксина эта величина составляет 120 мВ, т.е. превышает теоретическое значение для обратимого од-.ноэлектронного процесса. Редокс-потенциал тем не менее может быть определен как средняя точка между потенциалами катодного и анодного пиков,Для определения числа переносимых в реакции электронов находят высоту катодной или анодной волны.Способ расчета высоты представлен начертеже. Измеряют высоту катодной(или,анодной) волны или пика 1 отуровня тока контроля. В качестве такого уровня можно взять уровень тока электролита на модифицированномэлектроде. В этом случае ток восстановления поверхностно связанногоди-(4-пиридил)-дисульфида исключается. Измерение катодного пика ферредоксина делают после второго сканирования, при этом в качестве конт- -рольного уровня используют ток ферредоксина на немодифицированномэлектроде. Высоты волн, найденныеэтими двумя способами, совпадают.После того, как найден катодный(или анодный) ,ток, представляют егозначение в уравнение (1)и находятчисло переносимых электронов (и)Отношение найденной величины к 0,9,числу переносимых электронов, характерному для нативного ферредоксина,характеризует долю нативной формы впрепарате, Число п для нативного ферредоксина меньше 1, по видимому потой причине, что на стадии межмолекулярного электронного обмена в адсорбированном слое электронный обменнесколько заторможен.П р и м е р 1. Анализируют гомогенный препарат свежевыделенного издвухнедельных проростков гороха ферредоксина, который характеризуетсяотношениями пиков оптических плотностей А 42 о/Аат = 0,54; Ац/А д 7= 0,7,5.Модификация электрода.Вначалеповерхность золотого электрода тщательно полируют водной суспензиейАХ О , затем промывают бидистиллятом, Модификацию проводят путем пог 45Высоту волны находят как разностьтока в максимуме катодной волны навольтамперограмме, полученной привтором сканировании на модифицированном электроде, и тока при том же потенциале на катодной ветви вольтампе.рбграммы ферредоксина, снятой начистой поверхности электрода. В данном примере эта величина равна0,0 мкА. Тогда число переносимых 55электронов, рассчитанное по уравнению (1), равно 0,85. Отсюда доля активной формы ферредоксина, оцененнаяэтим способом, составляет 0,94. 5 О 5 20 25 30 35 40 ружения электрода на 3 мин в 10 И раствор ди-(4-пиридил)-дисульфида в 0,1 М К-фосфатном буфере, рН 7,0, После этого электрод промывают в буфере в течение 1 мин и переносят в электрохимическую ячейку.Электрохимическая реакция и снятие вольт-амперных кривых. Раствор ферредоксина предварительно очищают от низкомолекулярных соединений гель- фильтрацией на колонке с сефадексом С(элюируемый раствор 0,15 М ИаС 3. в 0,02 М трициновом буфере, рН 8). Анализируемый раствор содержащий 0,307 мМ ферредоксина, 0,17 М ИаС 3. в 0,02 М трициновом буфере, рН 8,0, помещают в электрохимическую ячейку, предварительно освобожденную от кис; лорода. Температура в ячейке 20 С. Раствор освобожпают от кислорода пропусканием очищенного водорода в течение 1,5 мин. После этого в ячейку помещают модифицированный золотой электрод (ц = 0,25 см ) и на него2подают начальное напряжение 0ЗВ (относительно насыщенного каломельного электрода). Далее снимают две катодно-анодные вольт-амперные кривые со скоростью развертки 0,25 В/с, потенциал точки поворота 0,78 В. В таких же условиях снимают вольтамперограмму ферредоксина на немодифицированном золотом электроде.Анализ вольтамперограммы. Потенциалы пиков: катодного - 0,69 В, анод- ного -0,57 В. Потенциал средней точки между потенциалами катодного и анод- ного пиков равен -0,63 В и близок к стандартному редокс-потенциалу для растительных ферредоксинов (-0,62) (-0,67)В. Катодный и анодный пики одинаковы, а разность потенциалов между ними составляет 20 мВ.,0 0 0,37 5 0 2 0 0 Примеч Поверхность электроПрепараты 1-3 - све2 мес при -5 С; 5 -течение О мин. и 5 1383111 р и м е р 2. Определение доли нативной Формы Ферредоксина в разных препаратах, Способ осуществляется согласно примеру 1 на препаратах ферредоксина, отличающихся спектральными характеристиками и активностью в реакции Фотовосстановления НАДФ.Результаты представлены в табл,1. Из табл,1 следует, что имеется корреляция между нативностью препарата, определенной согласно предлагаемому способу, и спектральными харак,теристиками и активностью в реакции фотовосстановления НАДФ+П р и м е р 3. Определениедоли нативного Фермента в смеси двух ,препаратов Ферредоксина, отличающихся в реакции фотовосстановления НАДФСпособ осуществляют согласно примеру 1 на смесях препарата Ферредок.сина 2 и 4 (табл.1). Концентрация белка в образце 0,25 мМ.Результаты представлены в табл,2. Иэ табл.2 видно, что доля нативной формы Ферредоксина, определенная вольтамперометрическим методомпо числу переносимых электронов,линейно зависит от соотношения препаратов различной, активности в анаЛизируемой смеси.Коэффициент корреляции для зависимости числа переносимых электронов от соотношения препаратов.ферредоксина различной активности составляет 0,997. Относительное среднеквадратичное отклонение тангенса угла наклона этой линейной зависимости равно 0,04.Предлагаемый способ позволяет упростить определение нативной формы Ферредоксина в его препаратах,Формула изобретения 1. Способ определения содержания нативной формы ферредоксина в его препаратах, заключающийся в регист.рации перехода электронов в реакции восстановления-окисления, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения анализа и улучшения его воспроизводимости, регистрацию перехода электронов осуществляют путем снятия циклических вольт-амперных кривых с использованием золотого электрода, модифицированного ди-(4- пиридил)-дисульфидом, при начальном . потенциале (-0,4)(-0,)В.и потенциале точки поворота (-0,78)(-0,80)В при скорости развертки потенциала 0,160,5 В/с и концентрации ферредоксина 1,9 1 О 38 х х 1 О моль/л,2, Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что снятие вольт-амперных кривых проводят последователь" но дважды и определение проводят по второй кривой. а равна 0,36 см.евыделенные; 4 - хранившийся термообработанный при 60 ОС в.Габлица 2 т Препа-Долярат препа Доля мкА ата меси 0,33 0,37 0 48,9 2,5 0,46 0,41 3,5 4,4 0,48 0,53 0,52 0,58 5,2 0,7 1,0 144 0,62 6,5 П р и м е ч а н и е. Поверхность электрода равна 0,36 см Активность мкмоль НАДФН/ мг хфч. 2 0,33 67,Ь 3 0 50 86 2 4 О,ЬЬ 57,6 нативнойформы