Способ сортовой идентификации пшеницы

(с1 сос;ь щими сортовое разнообразие пшеницы и других злаков (например, ржи).Способ заключается в том, ч;а ссртоную идентификацию зерна и муки пше-" ницы и других злаков гровсдят после фракционирования белков зерна электро форезом или изоэлектрическим фокусированием по спектрам ингибиторсн химотрипсина-субтилизина.Способ осуществляют следующим образом.Нанески зерна, отдельные зернонкй или часть их эндосперма размалывают. Белки извлекают из муки 4-кратным объемом воды (2 И мочевины, буфера или другого экстрагента). Смесь центрифугируют, осадок отбрасывают. Пронодят изоэлектрическое фокусирование фЭФ) белков н пластине бХ-ного ПААГ ницы ции и семеноводства селдр злаковизобр и повышение раз "сртовой идеиетенияобности решающетификациВозишающей и зр жными путями повыше ности сортовой я либо увеличе ракционировани ел которой ужелибо использо енти ипо е ации являют запаснь Фективности белков, пред ки достигнут.практичес ванне для тих целей ол ных систем елки-инги- изина, со"являютсяотражаюругих новле(муке) белков. Устбиторы хидержащиесявысокополим мотрипси зерн рфнымиГОСУДАРСТ 8 ЕнНый НомиТЕТпо изовретениям и отнытиямпРи гннт ссср(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт защиты растений иВсесоюзный научно-исследовательскийинститут растениеводства(5 б) Авторское свидетельство СССРУ 507271 ю кл А 01 Н 1104 э 1975(54) СПОСОБ СОРТОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИПШЕНИЦЫ(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биохимии растеИзобретение относится к биотехнологии, а именно к биохимии растений, и может быть использовано в области нии, и может быть использовано в области селекции и семенснсдства пшениць:, и других злаков. Цель изобретения - поьышение разрешающей способности сортовой идентификации. Способсостоит в.том, что сортовую идентификацию проводят после фракциониронания белков зерна злектрофсрезом илиизоэлектрофскусированием по спектрампнгибиторов химстрипсина-субтилизина,Способ позволяет идентифицироватьсорта сс сходными или близкими спектрами глиадина н частности сорта собщей родословной, которые не всегдаможно идентифицировать традиционнымиметодами пс спектрам Глиадинснтолщиной 0,2-0,3 мм, содержащего 27 амфолина, сервалитов или амфолитов отечественного производства с интервалом рН 4-9.5Образцы наносят на гель с помощью бумажных полосок в объеме 5-30 мкл в зависимости от чувствительности применяемого способа выявления ингибиторов. 10После ИЭФ в разделяющем геле выявляют ингибиторы химотринсина-субтилизина. Выявление ингибиторов может осуществляться методами, в которых используется желатиновый слой Фотопленок либо искусственные аналоги субстратов протеиназПоскольку данные ингибиторы бифункциональные, для проявления их спектров можно использовать любую из указанных протеиназ. Незначительныеотличия между спектрами, проявленные химотрипсином и субтили. зином, связаны с присутствием нескольких компонентов специфичных ингибиторов каждого из этих Ферментов, Мень шее число "лишних" компонентов наблюдается при проявлении спектров химотрипсином, однако последний можно испольэовать с ограниченным набором типов фотопленок. В свою очередь исгользование субтилизина обеспечивает несколько более высокую чувствительность анализа, более ровный фон и возможность работы со многими типами Фотопленок.По первому варианту метода выявле 35 ния спектров ингибиторов на гель накладывают бумагу, смоченную раствором протеиназы в 0,1 М ИаНРО 4 (концентрация химотрипсина 10-15 мкг/мл, субтилизина - 20 - 30 мкг/мл). Через10 мин бумагу удаляют и на ее место накладывают Фотопленку. Через 10-. 20 мин инкубации при 30-40 С Фотопленки накладывают на влажную фильтро- вальную бумагу. Последнюю слегка подсушивают сухой бумагой и отделяют от нее Фотопленку. На Фотопленке ингибиторам соответствуют темные полосы на светлом фонеПо второму методу после ИЭФ на гель накладывают фотопленку на 20 мин, затем переносят ее на бумагу, смоченную раствором химотрипсина (2"3 мкг/ /мл) или субтилизина (4-б мкг/мл) в 0,1 М МаНРО 4 и инкубируют в.таком55 виде 30-40 мин при 30-40 С. Бумагу годсушивают листом сухой бумаги и отделяют. фотопленку. Более высокое кач. во спектров получают при использовании в качестве поддерживающей среды вместо бумаги гель 0,8%-ной агарозы, содержащей 0,1 М ИаНРО 4 и протеиназу. Способы с использованием синтетических аналогов субстратов менее удобны из-за низкой чувствительности.Спектры ингибиторов из разных образцов серна сопоставляют между собой или со спектрами из предварительно составленного каталога, Можно записать спектр ингибиторов в виде формулы, предварительно обозначив возможные позиции компонентов в спектре.Способ основан, в частности, на том, что образцы, сходные по локусам глиадина, могут отличаться по другим локусам, в частност., чо локусам ингибиторов, если эти бразцы не полностью идентичны. Спектры ингибиторов химотрипсина-субтилизина у разных сортов и линий пшеницы, ржи и других злаков значительно отличаются по компонентному составу. уровень различий, выявляемых между образцами зерна, сопоставим с тем, что характе" рен для глиадинов, а в ряде случаев превосходит егоП р и м е р 1. Идентификация сортов пшеницы по ингибиторам химотрипсина-субтилизина.Зерна размалывают, белки извлекают 4-кратным объемом воды, смесь центрифугируют. ИЭФ проводят на готовой пластине 110 х 240 мм, В качестве анодного буфера используют смесь 0,04 М аспарагиновой и глутаминовой кислот, катодного - 2%-ные амфолины с рН 9-11. Образцы наносят на гель с помощью бумажных полосок 10 х 5 мм в объеме 20 мкл на расстоянии 15 мм от анода. На пластину шириной 110 мм наносят 15 образцов. Расстояние между электродами 160 мм (разгонку ведут вдоль пластины).ИЭФ ведут на приборе "Мультифор П" при мощности тока 8 Вт и напряжении 2500 В в течение 2 ч. Затем на гель накладывают предварительно увлажненную фотопленку. Через 20 мин пленку снимают, высушивают и накладывают на пластину 0,8%-ной агарозы, содержащей 0,1 М МаНРО 4 и химотрипсин (4 мкг/мл). Сверху помещают гибкую147199 формула изобретения Способ сортовой идентификации пшеницы, включающий фракционирование белков зерна, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения разрешающей способности, сортовую идентификацию проводят по спектрам ингибиторов химотрипсина-субтилизина. Составитель В,ДемкинТехред Л.Олийнык Корректор В,Романенко Редактор М.Петрова Заказ 1638/2 Тираж 618 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г,Ужгород, ул. Гагарина, 101 пластиновую иенку для предотвращения подсыхания фо.опленки и агарозы.оИнкубацию ведут при 30 С в течение 35 мин. Фотопленку помещают на лист5 влажной гладкой фильтровальной бумаги, слегка подсушивают и отделяют фотопленку. Ингибиторам соответствуют темные полосы на светлом фоне. Различные сорта пшеницы отличаются по спектра ингибиторов. По результатам анализов составляется каталог спектров ингибиторов, характерных для разных сортов, по которому в, дальнейшем сверяются при сортовой идентификации.П р и м е р 2. Сортовая идентификация зерна у сортов, трудноразличимых по глиадинам.Сорта Саратовской группы селекции трудноразличимы по глиадинам. Саратовская 36, Саратовская 42 и Саратов 9Оская 44 практически неразличимы между собой, а у Саратовской 33 и Саратовской 39 отличия по спектру глиадинов незначительные.Зерновки разрезаются пополам. У одной половинки определяют спектр глиадинов, а у другой - ингибиторов (см. пример 1), При проявлении спектров используют химотрипсин, Зерновки, не различимые по глиадинам, четко отличаются по спектрам ингибиторов.