Способ раннего прогнозирования гетерезиса по хозяйственным признакам у гибридов тутового шелкопряда

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 01 К 67 ЕТЕНИЯ дагогиРоссий одств ев,илип екото роди елко 1977 мии и сеа насекоие досто- прогнозиГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБР К А ВТОРСКОМУ С 8 ИДЕТЕЛЬСТ(71) Московский государственный печеский институт им. В. И. Ленина иская республиканская станция шелко(56) Егорова Т. А., Остапенко В. А.пович К. Б. Изучение активностирых ферментов гемолимфы и гренытельских пород и гибридов тутовогопряда. - В сб.: Биохимия насекомыхвып. 19, с. 29. Изооретение относится к биохлекции хозяйственно ценного видмых - тутового шелкопряда,Цель изобретения - повышеверности и сокращение временирования. Способ осуществляют следующим оразом.Наьеску грены (О,ступках при 0 С и бе0,15 М раствора хлние 15 мин. Экстрак8000 д в течение 2супернатанте определка по методу Бредфдля определения акти 2 г) гомогенизируют в лки экстрагируют 2 мл орида натрия в течет центрифугируют при 0 мин. В полученном яют концентрацию белорд и исследуют его вности ферментов. Ак.(54) СПОСОБ РАННЕГО ПРОВАНИЯ ГЕТЕРОЗИСА ПО ХОЗНЫМ ПРИЗНАКАМ У ГИБРИДВОГО ШЕЛКОПРЯДА(57) Изобретение относится к биохимии и селекции хозяйственно ценного вида насекомых - тутового шелкопряда. Цель изобретения - повышение достоверности и сокращение времени прогнозирования. Проводят определение удельной активности ферментов кислой фосфатазы, глюкозо-фосфатдегидрогеназы и кислой ДНКазы в белковых экстрактах грены пород и гибридов тутового шекопряда спектрофотометрческим методом, сравнивают значение удельной активности всех трех ферментов в грене тестируемых гибридов со среднеарифметическим значением удельной активности соответствующих ферментов в грене родительских пород и в случае повышенной удельной активности грены гибридов в сравнении с греной родительских пород делают заключение о наличии гетерозиса у тестируемых гибридов. 2 табл. тивность кислой фосфатазы определяют спектрофотометрически, в качестве субстрата используют и-нитрофенилфосфат. Для определения активности к 0,1 мл белкового экстракта добавляют 1,5 мл субстрата, растворенного в 1,4 мл 0,05 М ацетатного буфера, рН 4,6. Смесь инкубируют при 37 С в течение 20 мин. Реакцию останавливают добавлением 2 мл 0,2 М раствора Ма 00, В контроль белковый экстракт вносят после добавления щелочи. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при 405 нм. За единицу активности фермента принимают гакое его количество, которое катализирует высвобождение 1 мкмоль и-нитрофенола за 1 мин. Количество выделившегося нитрофенола определяют по калибровочной кривой.4 5 д Удельную активность рассчитывают в единицах активности на 1 мг белка,Активность глюкозо-фосфатлегидрогеназы определяют непосредственно в кювете спектрофотометра, внося в нее реакционную смесь в следующем составе: 1 мл глицин- АаОН буферного раствора (рй 9,5), содержащего 6 мМ р-меркаптоэтанола; 1 мл 3 мМ раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты; 1,8 мг глюкозо-фосфата в 0,1 мл дистиллированной воды; 1,8 мг НАДФ в 0,1 мл дистиллированной воды и 0,1 мл экстракта грены. Экстракт предварительно разбавля;от в 3 раза дистиллированной водой. Величину поглощения НАДФН измеряют в течение 5 мин при 340 нм. Активность рассчитывают по формулер; 34 ХГ 6,22где Аз 40 - прирост поглощения при 340 нм;Е - активность фермента (в единицахактивности);- объем пробы, мл;- время инкубации, мин:6,22 - коэффициент пересчета. За единицу активности фермента прини мают такое его количество, которое катализирует образование 2 мкмоль НАДФН вмин. Удельную активность рассчитывают в единицах активности на 1 кг белка, Активность кислой ДНКазы определяют спектрофотометрически, используя в качестве субстрата предварительно денатурированную нагреванием (100 С, 10 мин) высокомолекулярную ДНК. Инкубационная смесь для определения активности ДНКазы содержит О, мл 0,2%-ного водного. раствора субстрата; 0,2 мл 0,5 М ацетатного буфера (ро 5,2);0,1 мл 0,01 М раствора М С 2; 0,4 мл дистиллированной воды и 0,2 мл белкового экстракта. После инкуоации в течение 1 ч при 37 С смесь охлаждают в ледяной бане, добавляют 2 мл 0,5 М раствора х;орной кислоты и выдерживают при 0 С в течение 20 мин. Осадок отделяют центрифугирова.ием при 6000 д в течение 10 мин и измеряют оптическую плотность супернатанта при 260 мм против контрольной пробы, в которую фермент добавляют после инкубации. За единицу активности фермента принимают такое его количество, которое вызывает уве,ичение оптической плотности на 1 единицу зач. Удельную активность рассчитываот в единицах активности на 1 кг белка.Прирост или убыль удельной активностикаждого из исследованных ферментов в грене гибрида по отношению к таковой в грене родительских пород рассчитывают по формуле5=А - А.1 Х 100,А где 5 - прирост или убыль ферметатииной активности (в процентах);5 О 15 Р 5 30 А -- удельная активность фермента угибрида;А - среднее значение активности фермента у родительских пород.Если активность всех трех исследованных ферментов в грене гибридов превосходит среднее арифметическое значение активности ферментов в грене родительских пород, делают заключение о целесообразности выращивания данного гибрида, у которого следует ожидать гетерозис по ряду показателей (срелнему весу коконов, весу шелковой оболочки). Сопоставляют результать: определения удельной активности ферментов в грене пород и гибридов тутового шелкопряда (табл. 1). В грене гибрида ПС 5 ул х СК 2 наблюдается прирост удельной активности исследованных ферментов по сравнению со срелнеродительским показателем: значения лля активности кислой фосфатазы, кислой ДНКазы и глюкозо-фосфатдегидрогеназы составляют у данного гибрида +61,1 +63,3 и +38,8% соответственно. Гибрид ПС 5 ул х СК 2 яв.;яется перспективным. В грене гибрида СК 2 х САНИИШ 30 наблюдается снижение удельной активности по сравнению со среднеро,.ительским показателем: значения для активности киспой фосфатазы, кислой ДНКазы и глюкозо-фосфатдегидрогеназы составляют у данного гибрида - 38,8% - 604%, - 28,7% соответственно. Гибрид СК 2 х САНИИШ 30 следует признать неперспективным для выращивания. В результате контрольных выкормок данных гибридов было установлено, что гибрид ПС 5 ул х СК 2 проявляет гетерозис по среднему весу коконов и весу щелковой оболочки (на 0,4% и 7,1 % соответственно), а гибрид СК 2 х САНИИШ 30 не облалает гетерозисными свойствами по данным показателям (табл. 2).Результаты определения удельной активности кислой фосфатазы, кислой ДИКазы и глюкозо-фосфатдегидрогеназы в грене пород и гибридов тутового шелкопряда прел ставлены в табл. 1. Средний вес кокона и вес пелковой оболочки у порол и ибридов представлсны в табл. 2,Предлагаемый способ, основанный на точном количественном определении активности ферментов, позволяет в короткое время (в течение 1 рабочего дня проанализировать большое количество (несколько десятков) образ 1 ов грены. Данный способ более экономичен, поскольку не требует дополнительного оборудования (приборов лля проведения электрофореза и сканирования энзимограмм), открывает возможность быстрого массового определения удельной активности в большом количестве образцов грены тутового шелкопряда с целью раннего (на стадии яйца) прогнозирования гетерозиса у1468486 щийся тем, что, с целью повышения достоверности и сокращения времени прогнозирования, проводят определение удельной активности перечисленных ферментов и дополнительно кислой ДНКазы спектрофотометрическим методом, сравнивают значение удельной активности всех трех ферментов в грене тестируемых гибридов са среднеарифметическим значением удельной активности соответствующих ферментов в грене родительских пород и в случае повышенной удельной активности грены гибридов в сравнении с греной родительских пород делают заключение о наличии гетерозиса у тестируемых гибридов. тутового шелкопряда, что позволяет избежать дорогостоящих выкормок, необходимыхдля сопоставления показателей продуктивности у пород и гибридов насекомых. Формула изобретения Способ раннего прогнозирования гетеро- зиса по хозяйственным признакам у гибридов тутового шелкопряда, включающий определение активности ферментов кислой фосфатазы и глюкозо-фосфатдегидрогеназы в белковых экстрактах грены пород и гибридов тутового шелкопряда и суждение о гетерозисе выращиваемых гибридов, отличаюТаблица 1 Удельная активность (единиц/мг белка) х 10"з Породы и гибриды Глюкозо- Кислая - 6-фосфат- ДНКаза дегидроге- наза Кислаяфосфотаза 13,23 7,03 10,13 14,04 +38,67,03 9,93 6,49 2,57 - 60 8,48 6,05 -28,7 10,45 6,42 -38,6 П р и м е ч а н и е. Б - превосходство гибрида по сравнению со среднеродительеким показателем у исходных пород по уровню ферментативной активности,Та блица 2 Породы и гибриды Средний вес ко- Вес щелковой кона, г оболочки, г0,4170,3150,392(+7,1)0,3150,5080,298(-5,8) 2,141,591,95(+10,4)1,592,041,81(-0,2) ПС 5 улСН 2ПС 5 ул х СК 2СК 2САНИИШСК 2 х САНИИШ 30 П р и м е ч а н и е. В скобках указан прирост (+) или убыль (-) соответствующего показателя у гибрида по сравнению со среднеродительским показателем (в процентах). ПС 5СК 2СреднеродительскийПС 5 ул х СК 28(Е)СК 2САНИИШ 30СреднеродительскийпоказательСК 2 + САНИИШ 30Б(Е) 10,27 8,38 9,32 15,02 +61,1 8,38 12,53 11,73 5,03 8,35 14,71 +63,3 5,03 8,45