Способ получения лизирующих ферментов

1 1 6 О 487 О Союз Советских Социал истйческих1) М. Кл.е С 12 Р 13/1 23) Приоритет Государственный комите Совета Министров ССС по делам изобретенийи открытий Опубликовано 30.04 53) УДК 577.15(08 ллетень М 5) Дата опубликов описания 03,05.7(71) Заявители ельев, 3. Ф. Рахм следовательский и дена Ленина и ор ский институт им нова и В. Д, Кузиецонститут антибиотиковена Трудового Красно И. М. Сеченова го ОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЗИРУ 1 ОЩИ МЕНТО 2 лучение ферментгруппы А без рантигенов.Для достижения поставленной цели ироорганизмов рода Лс 11 погпусез использЛс(1 потпусез 1 ечопзЛс 11 потпусез 1 есопзАс 11 поп 1 усез 1 ечопзАс 11 погпусез 1 ечопзАс 11 потпусез 1 е опзЛс 11 погпусез дпзео 1 пзАс 11 погпусез а 1 Ьо 1 ачпзАс(1 погпусез дпзеосЬгогподепезАс 11 потпусез одогЛегАс 11 погпусез з 1 гер 1 огпус 1 пАс(1 погпусез с 1 гепзЛс 11 погпусез а 1 ЬпзЛс 11 погпусез зрес 1 езЛс 11 погпуссз зрес 1 ез з микуют: 692 67 С 4 95 109 88 194 275 406 187 454 492 161 О Сущность предлизирующих фечто перечисленнкультивируют нуглерода, азотачтительными явлстава, %:1. КазеиновыГлюкозаХлористый лагаемого способ ментов заключае те штамм ы ак среде, содержа и минеральные со яются питательн а получения тся в том, тиномицетов щей источникли, Предпоые среды со,1 - 0,8 ,2 - 1,6 ,2 - 0,7 й гидролиз атри Г. И. Петров, Е. П, Са Всесоюзный научно-и и Первый Московский о Знамени медициИзобретение относится к области биохимии, а именно к способам получения ферментов, лизирующих гемолитический стрептококк группы А.Лизирующие ферменты могут быть использованы для выделения и изучения изолированных антигенов стрептококка группы А в нативном состоянии, Кросме того, эти ферменты могут быть использованы для лечения таких заболеваний человека, как ангина, скарлатина, ревматизм, гломерулонефрит, острые респираторные заболевания верхних дыхательных путей и легких, рожи и др., а также в борьбе с носительством указанного возбудителя среди здоровых.Известен способ получения лизирующих ферментов путем культивирования микроорганизмов рода Ас 11 погпусез на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, и,последующего выделения ферментов 11.Недостатком известного способа является получение целевого продукта со значительным количеством трудноотделимых примесей протеолитических ферментов, оказывающих воздействие на иммуногенные белки, в связи с чем данный комплекс ферментов не может быть использован для получения специфических антисывороток.Целью настоящего изобретения является поов, лизирующих стрептококк азрушения стрептококковых604870 0,40 0,50 0,30 Литическая активность (Ж) приэкспозиции, ч АсИпотусев 1269267649510988194275 1 ечогз45 1 ечог 1 в1 ечогз1 ечог 1 в1 ечопз50 цв ва 1 Ьойачазяг 1 веосьгогпояепезойог 11 егзггергогпус 1 п 1с 1 ггецза 1 Ьцв 91,0 90,0 78,0 71,0 67,0 87,0 82,0 84,0 81,0 68,0 67,0 65,5 93,0 81,0 85 82 61 54 50 76 77 65 61 53 52 52 83 6040683187454492161 зр.зр. 3Фосфорнокислый калийдвузамещенный 0,1 - 0,511. Кукурузная мука 0,5 - 5,0Соевая мука 1,0 - 8,0 Фосфорнокислый калий 5двузамещенный 0,1 - 1,0Хлористый натрий 0,1 - 0,7 Цинк сернокислый 0,0001 - 0,001Выделение ферментов, лизирующих стрептококк группы А, осуществляют препаратив ным электрофокусированием в градиенте рН от 2 до 10 с последующим освобождением от амфолинов гельфильтрацией на Сефадексе 6-25.П р и м е р 1, Конические колбы емкостью 15 750 мл заполняют 100 мл жидкой питательной среды следующего состава, %:Казеиновый гидролизатХлористый натрийГлюкоза 20 Калий фосфорнокислыйдвузамещенный 0,15Вода водопроводная До 100 рН среды 7,2. Колбы инокулируют водной суспензией спор Ас 11 погпусез 1 ечопз 692, выра щенного в течение 14-ти суток при 28"С на агаризованной питательной среде с кукурузным экстрактом,После освобождения культуральной жидкости от мицелия центрифугированием (10 000 д, 30 10 мин) ферменты осаждают в течение ночи при 4 С сульфатом аммония (70% насыщения). Образовавшийся осадок центрифугирутю на рефрижераторной центрифуге (10 000 д;10 мин, 4"С). Г 1 олученный осадок белков рас творяют в 1 - 2 мл холодного 0,02 М бикарбонатного буфера и проводят обессоливание гельфильтрацией на Сефадексе б. Осадок растворяют в 1 мл О,И 2 М бикарбонатного буфера и хроматографируют на диэтиламино этилцеллюлозе (хроматографическая колонка 2,5 Х 30), Получают активную фракцию, содержащую ферменты, которую лиофильно высушивают и определяют литическую активность. 1 итическая активность Ас 11 погпусез 1 ечопз 692 составляет 85% при экспозиции 1 ч и 91% при экспозиции 4 ч.Пр имер 2. Конические колбы емкостью 750 мл заполняют 100 мл жидкой питательной среды следующего состава, %:Кукурузная мука 1,000 Соевая мука 2,000 Калий фосфорнокпслыйдвузамещенный 0,200 Натрий хлористый 0,500 Цинк сернокислый 0,001 Вода водопроводная До 100 Колбы инокулируют 5"по объему двухсуточного вегетативного мицелия Ас 11 погпусез 1 ечопз 67, выращенного на кукурузной среде 60 в колбах на круговых качалках при скорости 220 в 2 об/мин и температуре 28"С.После освобождения культуральной жидкости от мицелия центрифугиронанием (10000 д, 10 мин) ферменты осаждают в тече 4ние ночи при 4 С сульфатом аммония при насыщении 70%. Осадок центрифугируют на рефрижераторной центрифуге (10 000 д, 10 мин, 4 оС)Осадок белков растворяют в 1 - 2 мл 0,02 М бикарбонатного буфера, Для окончательной очистки ферментов проводят препаративное электрофокусирование в градиенте рН от 2 до 10. Полученную фракцию, содержащую фермент (рН 9,3), освобождают от амфолинов гельфильтрацией на Сефадексе Сг. Активную фракцию, содержащую фер-, менты, лиофильно высушивают и определяют . литическую активность Ас 11 потусез 1 ечопз 67, которая при экспозиции 1 ч составляет 82%.Для определения лизирующей активности используют суспензию клеток стрептококка группы А, тип 29 (штамм Д/11, 62/59 - Г 1 ражская коллекция). Реакционная смесь для определения активности лизирующих ферментов содержит 1,0 мл суспендированных клеток стрептококка в 0,075 М (рН 7,6) фосфатном буфере и 2 мл раствора фермента в том же буфере (100 - 150 мкг) .Об активности ферментов судят по изменению оптической плотности реакционной среды при 650 нм (температура 37 С, экспозиция 1 и 4 ч), которую выражают в процентах. Исходную оптическую плотность реакционной смеси (0,5 - 0,7 о. е,) принимают за нулевую точку.В таблице приведены данные по лизирующей активности ферментов, выделенных из культур актиномицетов. Все указанные в таблице культуры депонированы в коллекции культур ВНИИА под соответствующими регистрационными номерами. Полученные ферменты обладают высокой активностью, специфичностью и стабильностью. Они использованы для выделения и изучения нативных антигенов стрептококка груп604870 10 Формула изобретения Составитель Т. СеребренниковаРедактор Н. Хубларова Техред Н, Рыбкина Корректор А. Степанова Заказ 676/9 Изд, Уе 421 Тираж 568 НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Подписное Типография, пр. Сапунова, 2 5пы А. Антигены, полученные при помощи этих ферментов в соответствии с настоящим изобретением, имеют следующие преимущества: сохраняют нативную структуру и обладают специфическими иммуногенными свойствами; дают возможность получать специфические анти- сыворотки; открывают перспективу создания антистрептококковой вакцины. Способ получения лизирующих ферментов путем культивирования микроорганизмов рода Ас 11 погпусея на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, и последующего выделения ферментов, отличающийся тем, что, с целью получения ферментов, лизирующих стрептококк группы А без разрушения стрептококковых анти 6 генов, из микроорганизмов рода АсЫпогпусея используют: АсЫпогпусея 1 ечог 1 я 692 Ас 11 погпусея 1 ечог 1 я 67 5 Ас 11 потусея 1 ечопя 64 Ас 11 погпусея 1 ечопя 95 АсБпогпусея 1 ечопя 109 Ас 11 погпусея дг 1 яео 1 ця 88 АсЫпогпусея а 1 ЬоПачця 194 Ас 11 потусея дг 1 яеосЬгогпо 1 тепея 275 Ас 11 погпусея ойог 11 ег 406 Ас 11 погпусея я 1 гер 1 отус 1 п 1 83 АсЫпогпусея сйгеця 187 Ас 11 погпусея а 1 Ьця 454 15 Асбпогпусея ярес 1 ея 492 Лс 11 поп 1 у сея ярес 1 ея 161 Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР 528340,20 кл. С 13 К 1/00, 1975.