Способ определения активности гликогенфосфорилазы

(19 1) 4 С 12 ( 1/бб 3 ИЫЗЗР 3 ГИРЮ-Ь. лБ 103 Е,БЛ ИО г 4, ПИСАНИ БРЕТЕН ТЕЛЬСТ ВТОРСНОМУ СВ 28 моносова и Вс еский научный О.В,Л едева, а, И.Ф.Чер ю)1981,2 19 р.453 83, 13ааа у м н за ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГННТ СССР(71) МГУ им. М.В.Лосоюзный кардиологичцентр АМН СССР(56) Апа 1. Вз.осЬешУ 1, р,43-48.АгсЬ ВдосЬ, В 1 орР 1, р.285-291.МегЬ. Епгуш, 197488Апа 1 В 3.осмаев, 19р,318-323,Изобретение относится к биохимическому анализу, а именно к способу определения активности гликогенфосфорилазы, и может быть использовано для определения гликогенфосфорилазы в сыворотке крови.Цель изобретения - повышение чувствительности определения, сокращение времени проведения анализа, расширение диапазона измеряемых активностей, упрощение процесса.Изобретение заключается в том, что используют четырехферментную систему, включающую: фосфоглюкомутазу. глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу, НАДНа, ФМН-оксидоредуктазу и бактериальную(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ А 1(ТИВНОСТИ ГЛИКОГЕНФОСФОРИЛАЗЫ (57) Изобретение относится к биохимическому анализу, и может быть использовано для определения гликогенфосфорилазы в сыворотке крови. Целью изобретения является повышение чувствительности определения, сокращение времени анализа, расширение диапазона определяемых активностей и упрощение процесса. Изобретение состоит в том, что используют четырехферментную систему: фосфоглюкомутаза, глюкозо - 6-фосфатдегидрогеназа, НАДН : ФМН-оксидоредуктаза, бактериальная люцифераза, соим- а мобилизованную на ВгСИ-агарозе при рН 7,5-8,0, и процесс регистрации ведутлюминесцентным способом по на- . чальной реакции, катализируемой гли- С когенфосфорилазой. люциферазу, .которые предварительно соиммобилизуют на ВгСМ-агарозе..Соиммобилизацию ферментов прово дят путем инкубации буферного раст вора с рН 7,5-8,0, содержащего фос фоглюкомутазу (20-200 Е/мл), глюко зо-фосфатдегидрогеназу (10-100 Е /мл), НАДН . ФМН-оксидоредуктазу (2-20 Е/мл) и люциферазу (20-200 Е /мл) с суспензией ВгСИ-агарозы. занный диапазон активностейтов, используемый для анализася необходимым условием достивысокой чувствительности ана218 10 3 1497Каждому значению активностей любого из четырех ферментов соответ- .ствуют определенные оптимальныезначения активностей трех других ферментов, лежащие строго в указанныхдиапазонах. Использование ферментовс активностями, лежащими за пределами указанных диапазонов, приводитк снижению чувствительности анализа, поскольку зависимость активности иммобилиэованпых ферментов отих исходных активностей имеет колоколообразный характер,Для проведения анализа может бытьиспользован экстракт светящихся бактерий, получаемый фракционированиемэкстрактов бактерий Вепес 1 еа Ьагчеу 1 сульФатом аммония от 50 до 100 насыщения,Предлагаемый способ позволяетопределять гликогенфосфорилаэу в диапазоне активностей 0,01-10 Е, т,е,предел обнаружения снижается в пятьраз по сравнению с известным и наблюдается необходимое для целей медицинской диагностики расширение диапазона измеряемых активностей. Достигаемое повышение чувствительностианализа связано, по-видимому, с акти вацией полиферментной системы в соиммобилизованном состоянии.П р и м е р 1. Получение соиммобилизованной четырехферментной системы еЛиофилизованную ВгСИ-агароэу замачивают на 3 ч в дистиллированнойводе, затем промывают 1 мМ НС 1 иО, 1 М Иа-фосфатным буферным раствором, рН 7,8, В 0,1 М Ма-фосфатномбуферном растворе, рН 7,8, готовятраствор ферментов с общей концентрацией .белка 4-8 мг/мл, который содержит 100 Е/мл фосфоглюкомутазы,50 Е/мл глюкоэо-фосфатдегидрогеназы, 10 Е/мл НАДН : ФМН-оксидоредуктазы и 100 Е/мл бактериальнойлюциферазы. К полученному растворудобавляют ВгСИ-агарозу из расчета100 мп/мл и полученную суспензиюовстряхивают на качалке 20 ч при 4 С.Затем носитель промывают 0,1 М Иа"-фосфатным буферным раствором, рН7,0, содержащим 0,5 М БаС 1, до исчезнования ферментативной активности в промывных водах. Носитель симмобилизованными ферментами суспендируют в 0,5 М трис-ацетатном буферном растворе, рН 6,0, содержащем 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1 мг/мл аэида натрия, получают суспен эию с содержанием носителя 100 мг/мп, которую хранят при 4 С. Для длительного хранения суспензию лиофилизуют порциями по О, 5 мл.Удельная активность получаемых препаратов 4 О Е/ мп агар о зы,П р и м е р 2, Иммобилизацию проводят так же, как в примере 1 за исключением того, что раствор ферментов содержит 200 Е/мл фосфоглюкомутазы, 100 Е/мп глюкозо-фосфатдегидрогенаэы, 20 Е/мп НАДНФМН-оксидоредуктазы и 200 Е/мл бактериальной люциферазы. Удельнаяактивность получаемых препаратов30 Е/мл агарозы.П р и м е р 3. Иммобилизациюпроводят так же, как в примере 1за исключением того, что раствор ферментов содержит 20 Е/мл фосфоглюкомутаэы, 10 Е/мл глюкоэо- фосфатдегидрогенаэы, 2 Е/мл НАДН . ФМН-оксидоредуктазы и 20 Е/мл бактериальной люциферазы. Удельная активность получаемых препаратов 20 Е/мпагароэы,П р и м е р 4, Иммобилиэацию проводят так же, как в примере 1 заисключением того, что раствор ферментов готовят в 0,1 М Ба-фосфатном буферном растворе, рН 7,57.Удельная активность получаемых препаратов 30 Е/мл агарозы.П р и м е р 5, Иммобилиэацию проводят так же, как в примере 1 заисключением того, что раствор Ферментов готовят в 0,1 М Иа-фосфатном буферном растворе, рН 7,0. Удельная активность получаемых препаратов 25 Е/мл агарозы.П р и м е р 6, Определение активности глюкогенфосфорилаэы,При определении активности гликогенфосфорилазы в кювету люминометра последовательно вносят: 1 мл0,05 М трис-ацетатного буферногораствора, рН 6,8-7,0, 0,05 мл раствора гликогенфосфорилазы, 0,05 млраствора, содержащего 0,06 М ацетата магния, 30 мг/мп гликогена,0,15 мМ глюкозо,6-дифосфата.Смесьинкубируют в течение 8-12 мин при30 С. Затем в кювету добавляют 0,05 мпсуспензии соиммобилизованной четырехферментной системы, приготовленной, как указано в примере 1, 0,1 мл0,3 мМ раствора деканаля в 2 -ному = 1,00 х - 8,20,где у - 1 1 (интенсивность свечения, В);х - 1 ц С (интенсивность глюкозо - 1 - фосфата, И). Расчет активности гликогенфосфорилазы в МЕ (мкМ/мин) проводят по формул е А = 1 с А активность гликогенфосфорилазы, МЕ;- активность гликогенфосфорилазы, В/мин; где А А где Ч объем реакционной смеси,мл (1, 5);объем раствора гликогенфосфорилазы, мп (0,05),5 149 п-пропаноле, 0,05 мл 30 мМ раствора НАД в воде и регистрируют фоновое свечение. Добавляют 0,1 мл раствора 0,15 М фосфата и полученную смесь инкубируют в течение 1 мин. Затем в течение 2 мин регистрируют увеличение интенсивности свечения при постоянном перемешивании. За меру активности гликогенфосфорилазы принимают тангенс угла наклона получаемой прямой (В/мин).Укаэанная последовательность операций при проведении анализа, а именно раздельное добавление субстратов гликогенфосфорилазы (сначала гликогена, а затем после инкубации неорганического фосфата), необходима для стандартизации условий регистрации свечения, В противном случае не наблюдается воспроизводимости экспериментальных данных.Перевод активности гликогенфосфорилазы в международные единицы (мкМ/мин) осуществляют по калибровочному графику зависимости свечения от концентрации глюкозо-фосфата (продукта гликогенфосфорилазной реакции).Калибровочный график представляет собой прямую в интервале концентраций глюкозо-фосфата от 1 нМ до 10 мкМ, Калибровочную прямую обрабатывают по методу наименьших квадратов, Получают уравнениеприготоленных растворов ,лпкогепфосфорилазы. Результаты препставлсны ниже.5Введено гликогенфосфорилазы, МЕ Сигнал,мВ/мин 0,01 0,05 0,10 0,25 0,50 1,00 5,00 10,00 3,0 5,3 7,5 18 35 62,5 307 613 10 15 Полученные данные обработали пометоду наименьших квадрато. Полу чили уравнение: у =. 61,04 х + 2,44,где у - сигнал (мВ/мпн); х - введенное количество гликогенфосфорилазы (ИЕ) .Ошибка определения не превышает 25П р и м е р 7. Определение ак -тивности гликогенфосфорила зы В,Определение активности гликогенфосфорилазы В проводят так же, как 30 и определение активности гликогенфосфорилазы, за счет исключениятого, что раствор, содержащий гликоген, ацетат магния и глюкозо,6-дифосфат, содержит еще 0,03 И АИР.Соиммобилизованная система приготовлена, как указано в примере 1,Введено 0,3 Е гликогенфосфорилазы.Определено 0,28 Е гилкогенфосфорилазы. Ошибка определения 107,.40 П р и м е р 8. Определение активности гликогенфосфорилазы в сыворотке кровиСыворотку крови пропускают черезколонку, заполненную крахмалом, Крах мал (20 г) суспенидруют в 40 мп0,02 М трис-ацетатного буферного раствора, содержащего 1 мМ дитиотреитола, и оставляют набухать в течениео2 ч при 4 С, В колонку (1 х 5 см)вносят 2 мл суспензии крахмала.Затем пипеткой 1 мл сыворотки крови,После нанесения сыворотки крови вколонку вводят 2 мл 0,02 М трис--ацетатного буферного раствора, рН7,0, затем элюируют гликогенфосфорилазу 1 мл 0,05 М трис-ацетатного буферного раствора, рН 7,6, содержащего 10 мг/мп гликогена и 0,05 мМЭДИА, при 20 С.1497218 Способ определения активности гликогенфосфорилазы, предусматриващий использование четырехферментной системы, содержащей фосфоглюкомутаСоставитель А.ПугачТехред М.Ходанич Корректор М.Шароши Редактор Н.Киштулинец Заказ 4406/29 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 Для очистки следующей, порции сыворотки используют новую порцию крахмального геля.Активность гликогенфосфорилазы в элюате определяют, как описано в примере 2, но вместо 1 мл трис-ацетатного буферного раствора и 0,05 мл раствора фермента используют 0,5 мп элюата с колонки и 0,5 мл трис-ацетатного раствора, рН 7,0 Использованная четырехферментная соиммобилизбванная система приготовлена, как указано в примере 1. Расчет активности гликогенфосфорилазы в МЕ прово дят так же, как в примере 6, за исключением того,. что объем сыворотки 0,5 мпФормула изобретения 20 лу; глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу,оксидоредуктазу и бактериальную лю" циферазу, с последующей оценкой результатов биолюминесценцией, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности определения гликогенфосфорилазы, сокращения времени анализа, расширения диапазона измеряещх активностей и упрощения процесса, используют ферменты, соиммобилизованные.на ВгСИ-агарозе при рН 7,5-8,0, при содержании фосфоглюкомутазы 20-200 Е/мп, глюкозо- -6-фосфатдегидрогеназы 10-100 Е/мл, НЛДН , ФМН-оксидоредуктазы 2-20 Е/ /мл и бактериальной люциферазы 20 - 200 Е/мл, определение ведут путем последовательного добавления к анализируемому образцу гликогена суспензии соиммобилизованных ферментов и их субстратов и затем неорганического фосфата,а результат оценивают по начальной скорости реакции, катализируемой гликогенфосфорилазой.