Способ определения аминоглютетимида в биологической жидкости

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК А 1 4 С 01 М 33/4 РЕТЕНИЯ медициения л имер амиих жидследова екцийовьпп ова ят диазои азософтил)- м. Полу- миноглюте 4, 7.3 метри АМИНОГЛЮТЕ КОСТИи энергичт при ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Ленинградский научнотельский институт детских(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯТИИИДА В БИОЛОГИЧЕСКОЙ Изобретение относится к медицине, в частности к методам определения лекарственных препаратовв биологических жидкостях, и касаетсяспособа определения аминоглютетимида. 5Цель изобретения - упрощение иповьппение точности способа.Цель достигается за счет проведения диазотирования аминоглютетимидаи азосочетания с 0,052-ным 11-(1-нафтил)-этилендиамин-дигидрохлоридом(НЭД). Полученное диазопроизводноеаминоглютетимида определяют спектро,фотометрически (или фотометрически)при длине волны 560 нм. 15Способ осуществляется следующимобразом,В центрифужные пробирки, содержащие 1,4 мл дистиллированной воды,приливают по 0,1 мл крови или мочи20(57) Изобретение относитсяне, касается методов опредекарственных препаратов, напрноглютетимида, в биологическостях. С целью упрощения иния точности способа проводтирование аминоглютетимндачетанив с 0,057.-ным М-(1-нэтилендиамин-дигидрохлоридченное диазопроизводное атимида определяют спектрофчески (или фотометрически)=560 нм. 2 табл. на 5-10 мин, центрифугируют 20 мин3000 об/мин. Центрифугат разливаютв две пробирки (не очень широкие)по 0,5 мл, прибавляют в каждую поО, 1 мл 4 н. НС 1 и перемешивают, Одну из пробирок закрывают фольгой иставят в кипящую водянуюбаню на45 мин. Все пробирки (гидролизован"ные и негидролиэованные) охлаждаютв обычном холодильнике при 4 фС в течение 30 мин, затем прибавляют по0,1 мл свежеприготовленного 0,2 Хного Г 1 аМО, встряхивают, через 4 минприливают 0,1 мл 1 Х-ного аммониясульфановокислого, встряхивают, через 2 мин приливают 0,2 мл 0,053-ногоНЭД, встряхивают, ставят на 1 ч втемное место, периодическ новс тряхивают, фотометрирую560 нм, путь луча 1 см. Количествоаминоглютетимида рассчитывается покалибровочной кривой. Для ее построения в пробы вместо крови или мочиприливают О, 1 мл стандартного раствора с известным содержанием аминоглютетимида от 1,0 до 10 мкг (табл.1). По стандартной кривой находят коли" чество аминоглютетимида, соответствующее полученной экстинкции при определении, т.е. количество аминоглютетимида в мкг, содержащееся в О, 1 мл крови (или в мг в 100 мл , крови), а для мочи это количество умножается на разведение мочи в 5 раз и на суточный объем мочи.При обследовании животных и человека, принимавших аминоглютетимид, были получены результаты, представленные в табл,2.Аминоглютетимид вводили животным внутрибрюшинно натощак в количестве 20 мг на 1 кг веса, кровь брали в гепаринизированные пробирки через2 ч после введения.В лечебных целях аминоглютетимид применяли рег ов по 250 мг 4 раза в сутки, кровь брали утром натощак через 2 ч после последнего приемапрепарата.Мочу в обоих случаях собирали втечение суток.П р и м е р 1. Определение концентрации аминоглютетимида в крови,У человека, принимающего в лечебных целях аминоглютетимид,взялиФ0 1 мл крови из пальца утром натощак, внесли ее в центрифужную пробирку, содержащую 1,4 мл дистиллированной воды, перемешали и прилили 0,5 мл 207-ной трихлоруксусной кислоты, тщательно перемешали стеклянной палочкой и центрифугировали 20 мин при 3000 об/мин, Центрифугат разлили по 0,5 мл в 2 пробирки (не очень широкие) с внутренним диаметром 8-10 мм, чтобы не было значительного испарения проб при нагреве), В обе пробирки приливали по 0,1 мл 4 н. НС 1, перемешали, одну из них закрыли фольгой и поставили в водяную баню (кипящую) на 45 мин, другую оставили при комнатной температуре. Через 45 мин пробу вынули из водяной бани, некоторое время охлаждали на возбухе и обе пробирки поместили в обычный холодильник (С=4 С) на 30 мин, после чего провели диазотирование путем прибавления в пробы по О, 1 мл 027-ного МаИО , через 4 мин убрали избыток нитрита О, 1 мл 1 Е-ного аммония суль 5307 30 35 40 45 50 55 10 15 20 25 фаминовокислого, а через 2 мин провели азосочетание,. приливая 0,2 мл0,05 -ного И-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлорида. Пробы оставили на1 ч в темноте, периодически встряхивая для удаления пузырьков газа. Через 1 ч их фотометрировали при длиневолны 560 нм. В гидролизованной пробе определили общий аминоглютетимид,в негидролизованной - свободный, т.е.неацетилированный, аминоглютетимид.По разности между общими и свободнымаминоглютетимидом определили количе"ство ацетиламиноглютетимида. Расчетвели по калибровочной кривой со стандартными растворами аминоглютетимида,содержащими 1,25; 2,5; 5,0; 7,5 мкгаминоглютетимида в О, 1 мл крови.Например, величина экстинкции в гидролизованной пробе 0,190, что соответствует по стандартной кривой 3,5 мкг,а в негидролизованной - О, 120, чтосоответствует 2,5 мкг, следовательно,количество общего аминоглютетимидав крови равно 3,5 мг в 100 мл, асвободного - 2,5 мг в 100 мл, количество ацетилированного аминоглютетимида 1,0 мг в 100 мл,П р и м е р 2, Определение концентрации аминоглютетимида в моче.У человека, принимающего аминоглютетимид, собрали суточную мочу, развели ее дистиллированной водой в 5 раз и 0,1 мл разведенной мочи обработали так же, как О, 1 мл крови (см. пример 1), При расчете полученный результат умножили на разведение мочи и на суточный объем мочи. Формула и з о б р е т е н и я Способ определения аминоглютетимида в биологической жидкости, путем определения белка, обработки супернатанта реагентами с последующей спектрофотометрней, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа, супернатант разделают на две пробы, обрабатывают их трихлоруксусной кислотой, затем одну из проб гидролизуют при кипячении, в качестве реагентов используют азотистокислый натрий и И (1-нафтил)-этилендиамин-дигидрохлорид, обработку которыми проводят последовательно в течение не именее четырех минут первым и5 1455307 6не менее часа - вторым, а аминоглю- тинкции гидролизованной и негидролитетимид определяют как разность в зкс- зованной проб при длине волны 560 нм.1Таблица 1 Величина экстинкции при определенииаминоглютетимида в стандартных растворах с разной концентрацией И-(1 нафтил)-этилендиамин-дигидрохлорида Аминоглю- Оптическаятетимид плотность0,057.-ногонэд Е 560 нм (1=1 см) О, 1 Ж- ного НЭД 1,25 2,50 5,00 Таблица 2 Аминоглютетимид КолиОбъект чество обслеСвободный Ацетилиро- ванный Общий дованных МышиКровь 1,42+ 0,09 0,92+ 0,06 0,50+ 0,05 КрысыКровь 0,74+ 0,06 0,40+ 0,03 0,34+ 0,040,931+0,120 0,209+0,036 0,7220,085 Моча Человек 2Кровь 0,19 0,91 1,10 0,28 0,95 1,23 270,0 220,0 Моча П р и м е ч а н и е. Кровь - мкг в 100 мл;моча - мг/сутки. Составитель А.АгуреевРедактор Л.Пчолинская Техред М.Дидык Корректор Н,Король Заказ 7452/53 Тираж 788 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород ул. Проект ая,ектная 4 470,0 338,0 0,065 О, 120 О, 262 0,064 О, 117 О, 291 200,0 118,0