Способ диагностики гепатита

(51) 6 01 й 1 28 А 61 В 10 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСНООУ СВИДВТВЪСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Рижский медицинский институт(56) 1. Оезвет Ч, 8. 0 е Могйщепезе бегсйговзсЬеп Нерат 16 з Мцпсп, гпед Взспг,1978, ч. 120, чч. 46, р. 1523-1532.2, Авторское свидетельство СССРИф 594965, 28,02.78,(54) (57) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЕПАТИТА путем смешивания крови больного с ЯО1141 Об А антикоагулянтом, выделения клеток лим.фомоноцитарной смеси и подсчета из нихфиксированных на стекле, о т л и ч а ющ нОй с я тем, что, с целью дифферен.циальной диагностики хронического персисти.рующего и хронического активного гепатитав период ремиссии, лимфомоноцитарнуюсмесь наносят на стекло в виде висячей капли, при этом смесь готовят на среде с10% пулированной сыворотки АВ группыкрови и берут в концентрации 2,5 х 10 кл/мл,и при показателе фиксированных клеток. от 9 до 36% диагностируют хроническийактивный гепатит, а при показателе фиксированных клеток от 1 до 8% - хронический персистирующий гепатит,0 20 Изобретение относится к медицине и касается способа диагностики гепатита.Известен способ дифференциальной диагностики хронического активного гепатитад стадии ремиссии и хронического персистирующего гепатита 111,Однако диагностика затруднена из.засходства клинико-биохимических и морфо.логических проявлений болезни,Известен способ диагностики гепатита,заключающийся в том, что смешиваюткровь больного с антикоагулянтом, вьгделяют лимфомоноцитарную смесь, подсчитывают клетки, прилипшие (фиксированные)на стекле 2.15Однако известный метод обеспечивает ди.агностику острого вирусного гепатита В ине отграничивает хронический персистирующий гепатит и хронический активный гепатит в период ремиссии.Целью изобретения является дифференциальная диагностика хронического персисти.рующего гепатита и хронического активно.го .гепатита в период ремиссгпг,Указанная цель достигается тем, что 25согласно способу диагностики гепатита,включающему смешивание крови больногос антикоагулянтом, выделение клеток лимфомоноцитарной смеси и подсчет из нихфиксированных на стекле, лимфомоноцитар"ную смесь наносят на стекло в виде висячей капли, при этом смеси готовят насреде с 10% пулированной сыворотки АВгруппы крови и берут в концентрации2,5 х 10 кл/мл, и при показателе фиксиро.ванных клеток от 9 до 36% диагностируют35хронический активный гепатит, а при показателе фиксированных клеток 1 - 8%хронический персистирующий гепатит,Способ осуществляют следующим образом,У больного забирают 3 мл периферичес.40кой крови в пробирку с 60 ед. гепарина.Лимфомоноцитарную взвесь, выделеннуюна градиенте плотности фиколл-верографина(1,077), разводят питательной средой 199,45содержащей 10% пула инактивированныхсывороток доноров У/АВ группы крови,до концентрации 2,5 х 10 клеток в 1 мл.Из капли взвеси делают мазок для подсчета процентного соотношения лимфоцитов50и моноцитов,По 0,01 мл указанной взвеси (2.5 х 10 кле.ток) автоматической пипеткойнаносят надва квадрата площадью 0,25 см, выграви.грованных на предметном стекле (стеклотщательно обсзжирено кипячением в раст 55воре стирального порошка и дистиллированной воды и последующим содержаниемв 96 спирте), инкубируют 1 ч .при 37 С, Затем стекло переворачивают для образования феномена "висячей капли" и втаком положении оставляют 20 мин прикомнатной температуре. Неприлипшие клетки, сконцентрированные в "висячей капле",удаляют полоской фильтровальной бумаги,которую осторожно прикладывают к краюквадрата, Затем 0,04 мл среды 199 с указанной сывороткой наносят на каждыйквадрат для дополнительного отмываниянеприлипших клеток. Жидкость сразу жеотсасывают полоской фильтровальной бумаги.Препарат высушивают, фиксируют 5. минметанолом и окрашивают по Романовско.му-Гимзе,Дифференцированный подсчет лимфоцитови моноцитов производят по всей площадиквадрата при световой микроскопии (увеличение х 630).Процент прилипших клеток выечитываютпо формуле: ААр х 100%2500 где А - общее число прилипших по всейплощади квадрата клеток;2500 - число клеток, внесенных в квадрат,Пример расчета, Определяют процент прилипания клеток по формуле д: - зх 100%,о 9 где А,М- процент прилинания;- количество прилюшпгх клеток;- количество клеток, использованных в реакции.Тогда при А= 908 и М: 2500 А =36,3%; при А,=225 и М = 2500 А =9% фри показателе процента прилипаония 36, 3 и 9% у больного диагностируют хронический активный гепатит в стадии ремиссии); при А= 25 и М т 2500 А "- 1%; при А = 200 и М : 2500 А=8% (при по 1казателе процента прилипаиия 1 и 8% у больного диагносцируют хронический пер. систируюший гепатит) .П р и м е р 1. Больная О., 19 лет, клинический диагноз - хроническйй актив. ньгй гепатит (диагноз выставлен в 977 г. на основании клинико-биохимических данных; слабость, желтушность, гепатоспленомегалия; АлАТ 6,25 моль; билирубии 2,5 мг%; т-глобулиньг 42% и инструментальных методов исследования: скенированиеи пункционная биопсия печени). На осно.ванин указанного больной была назначенатерапия кортикостероидами, которую прово.дили до 1980 г.К январю 1980 г, достигнута клкникобиохимическая ремиссия (билирубин 0,4 мг%;АлАТ 0,69 моль; т -глобулин 23%; жалобнет). При лункционной биопсии печени в .1980 г. - в препарате ткань печени беэпризнаков явной патологии.Предлагаемым способом диагностики определено высокое число прилипающих кле.ток (36,1%), на основании чего было ди.агностировано наличие хронического активного процесса в печени. При дальнейшемнаблюдении за больной диагноз был под.твержден обострением процесса в августе1981 г. (билирубин 2,5 мт%; АлАТ3,5 моль; у -глобулины 32%).Больная находится на диспансерном наблю.денни, В течение 1981 - 1983 г, постояннопринимает поддерживающие дозы преднизо.лона из-за периодического повышения АлАТП р и м е р 2. Больная П., 58 лет,клинический диагноз - хронический активный гепатит, развивающийся после тяЖелойформы вирусного гепатита, перенесенного в1978 г, Диагноз выставлен на основанииклинико-биохимических данных и морфологического исследования печени. Больную ле.чили преднизолоном и к маю 1980 г. быладостигнута клинико-биохимическая ремиссия(билирубин 0,7 мл%; АлАТ 0,13 . моль;Т.глобулины 23%),Предлагаемым способом диагностики вэтот период определено высокое число прилипающих клеток (9,0%) и диагностированоналичие хронического активного процессав печени, что подтверждено результатомморфологического исследования (при пункционной биопсии печени в препарате выявлен перипортальный гепатит с переходом в,цирроз печени) и дальнейшим наблюдениемза больной: в сентябре 1981 г. больнаяпоступила в клинику с тяжелым обострени.ем процесса (билирубин 11,3 мл%; АлАТ4,3 моль; Т-глобулины 43%). С этоговремени находится на диспансерном наблюдении и поддерживающих дозах преднизолона (нестойкая ремиссия).П р и м е р 3, Больной К., 47 лет.В 1979 г. перенес острый вирусный гепатитв средней тяжести, В дальнейшем сохранилось персистирование НВ А при несколькоповышенном содержании билирубина (1,8 ьш%)и активности АлАТ (1,29 моль).При исследовании предлагаемым методомчисло прилипающих клеток составило 1,1%,5 10 15 Ы 25 30 35 40 45 50 55 на основании чего был выставлен диагноз:хронический персистирующий гепатит (исследование проведено 02.01.80). Позже диагнозподтвержден результатом морфологическогоисследования (при пункционной биопсиивыявлен нерипортальный гепатит, т.е. хронический персистнрующий гепатит).В течение последующих двух лет обострений заболевания отмечено не было, нопри биохимическом исследовании в 1981 г,выявлено повышенное содержание АлАТ(1,68 моль) при нормальных значенияхбнлирубина (0,7 мл%) и осадочных проб(сулемовая проба 80%; тимоловая 4,5 ЕД),что свидетельствует о наличии невыраженного воспалительного процесса в печениблагоприятного течения, при котором применение кортикостероидов не ноказаю.П р и м е р 41- Больной Б 25 лет.В октябре 1979 г, перенес острый вирусныйгепатит, В дальнейшем при клинико-биохими.:ческбм наблюдении за больным постоянно выявляли некоторое повышение содержаниябилирубина крови (13,12,79 г. 2,5 мт%;06.06.80 г. 1,2 мг%; 05,09.80 г. 2,1 мт%),а при морфологическом исследовании - впрепарате картина портального гепатита. Наосновании указанных исследований больномувыставлен диагноз - хронический персистирующий гепатит н с 1980 г. он находитсяна диспансерном учете,Предлагаемым способом диагностики10.10.80 г. у больного в крови определено 8% прилипающих клеток, что подтверж.дает указанный диагноз и свидетельствуето благоприятном течении заболевания,Таким образом, предложенный способдиагностики позволяет в 80 - 90% случаевдостоверно дифференцировать хроническийперсистнрующнй гепатит и хронический активный гепатит в стадии ремиссии.В процессе экспериментальной разработкиспособа выявлены следующие особенности.С помощью создания феномена "висячаякапля" удается избавиться от неприлиншихк стеклу клеток, не травмируя оставшиесяна стекле фикеированные (прилипшие) клет.ки. Прополаскивание или промывание стекла приводит к нарушению целостности кле.ток и сопровождается невоспроизводимостьюрезультатов, При создании феномена "висячая капля" клетки, не прилипшие или сла.бо прилипшие к стеклу, в силу физичес.ких свойств стекают в каплю и убавляютсяфильтровальюй бумагой, чем достигаетсямаксимальная стандартизация удаления клеток без нарушенияих структуры и функции.В качестве среды для инкубации лимфомоноцитарной смесиследует использовать41306 Составитель 3. ВальковскаяТехред О.Неце Корректор С. Черни Редактор А. Шишкина Заказ 487/31 Тираж 897 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5Филиал 1 ПП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 411 смесь питательной среды с 10% пулирован. ной сыворотки крови доноров АВ (1 Ч) группы. Использование физиологического раст,вора или фосфатного буфера вместо питательной среды для кратковременного культивирования приводит к снижению жизне. способности клеток. Необходимо использо. вать пулированную сыворотку крови здо ровых доноров АВ (Ч) группы крови, так как применение аутологичйой сыворотки неадекватно нз-за наличия в ней блокирующих факторов при хронических заболеваниях печени.Для нанесения на стекло целесообразно использовать концентрацию клеток 2,5 х х 10 в,1 мл (2500 клеток на пробу),При использовании менее,2000 клеток напробу в случаях низкого процента прили.пания на стекле оставались единичные клетки, что затрудняло оценку реакции, Прииспользовании более 3000 клеток на пробув случаях высокого процента прилипанняподсчет прилипших клеток был затруднениз.за большого их числа и образования конгломератов, что ухудшало воспроизводимость16 результатов,Предлагаемый способ позволяет достоверно (в 80 - 90% случаев) дифференцироватьхронический персистирующий гепатит и 15 хронический активньв гепатит в стадии %ремиссии,