Способ определения гидрофобности белков

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН 9) с 1 С 01 Н 33/ п,1ПАТЕЛ,;Б"Ь;,1,ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИК АВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГИДР ОФОБНОС едователь В.Р, Вил сьСу гоЬе вцг 624,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(71) Казахский научно-исслкий институт земледелия имямса(56) КаСо А., МаСвцйа Т., МаСвпйопа В., КоЬаувЫ. К., ЭеСегшдпаСз.опоЕ РгоСе 1 п НуогорЬоЬхсдСу 11 вюЯойхиш Эойесу 1 ЗпвйаСе Вдпйищ МеСЬой. - Л.Аяг 1 с. Тоой СЬев, 1984,У 2, 284-288.Кайо А., КаМа 8. НуйгорЬоЬ 1йеСегпп.пй х йу а Р 1 оогевсепсе РшеСЬой апй хСв согге 1 аСюп МЕСЬЙасе ргорегЫев ой огоСепв. - В 3.осЬеш, еС В 3.орЬув. АсСа, 1986,В 1 1320,Кеупо 1 йв ,Т.А Тап 2 огй С., ТЪе1 говв СорйогшаЫоп от РгоСеЫ - вйдпш Войесу 1 ва 11 аСе СошреехевЛ. В 3.о 1. СЬеш, 1970, 245У 19,5761-5765.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯе ТИ БЕЛКОВ(57) Изобретение относится к области физико-химической биологии и биотехнологии и позволяет повысить разрешаюцую способность й точность анализа при исследовании Физико-химических и функционапьных свойств биополимеров. Гидрофобность белковых компонентов гетерогенного белка определяет после электрофоретического деления в полиакриламидном геле и денатурации их по интенсивности связывания детергента - додецилсульфата натрия и рассчитывают количество додецилсульфата натрия (мкг) на 100 мкг белка.1 табл, 1451599.Изобретение относится к области физико-химической биологии и битехнологии, а именно к биологической и аналитической химии, и может быть5 и спольз он ано научными учреждениями , для изучения структуры физико-химических, функциональных свойств биополимеров и природных соединений.Целью изобретения является усиле ние разрешающей способности и повыше" ние точности анализа при исследовании физико-химических и функциональных свойств белков.Способ заключается в том, что про. - 15 водят разделение гетерогенного белка на фракции методом электрофореза в полиакриламидном геле с одновременным концентрированием фракций в небольшом объеме. Гидрофобность 20 компонентов гетерогенного белка оп.ределяют после их денатурации трихпоруксусной кислотой в геле путем окрашивания метиленовым голубым после обработки детергентом - додецил сульфатом натрия.П р и м е р. Препарат зеина, полученного из эндосперма кукурузы, в количестве 200-300 мкг наносят на каждую из трех дорожек и подвергают З 0 электрофоретическому разделению в попиакриламидном геле.Пластину геля помещают для денатурации разделенных белковых компонентов эеина в 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты на 1 ч. Затем раствор кислоты сливают и операцию повторяют еще раз. Одну из дорожек вырезают из ппастины и окрашивают 0,05 Е- ным раствором кумасси Кв тече ние 90 мин отают дорожку от избытка красителя дистиллированной водой и интенсивность окраски белковых компонентов определяют денситометрически (вариант в).41Пластину геля с оставшимися двумя дорожками обрабатывают 0,02 И натрийфосфатным буфером рН 7,0 в течение 1 ч. Раствор смывают и операцию пов" торяют до тех пор пока рН промывного 1: 050 буфера не достигнет нейтрального значения,Дорожки отделяют друг от друга и одну из них окрашивают 0,002-0,004 Ж- ным раствором метиленового голубого в течение 2 ч. После этого гель отмывают от избытка красителя дистиллированной водой и определяют интенсивность окраски белковых компонентов денситометрически (вариант б),Другую дорожку обрабатывают 0,14- 0,20 мМ додецилсульфата натрия в течение 2 ч. Затем освобождают гель от избытка детергента промывкой натрийфосфатным буфером рН 7,0 (пять раз по 1 ч) и гель окрашивают так же, как и в варианте б, и проводят денсит ометрию ( в ари ант а)Все операция с гелями проводят накачалке при,постоянном режиме встряхивания и комнатной температуре.Расчет гидрофобности белковыхкомпонентов приведен в таблице.Количество белка в группе компонентов и количество додецилсульфатанатрия (ДДС-На), связанного с белкомнаходят по соответствующим стандартным калибровочным кривым. 1"идрофобность групп белковых компонентов определяется количеством ДДС-Ма, связанным 100 мкг белка: чем выше значения такого показателя, тем болеегидрофобным является белок,Известный способ позволяет определить лишь суммарную гидрофобностьпрепаратов белков, а предлагаемый,способ после электрофоретическогоразделения позволяет дифференцировать по гидрофобности составляющиепрепарат компоненты и группы компонентов,Повышение точности анализа достигается тем, что после электрофорезаимеется возможность определить гидрофобность низкомолекулярных компонентов, которые по известному способу могут теряться в процессе диализа препаратов белка.По прототипу суммарнаягидрофоб- ность препарата зеина составила 0,90 мкг ДДС-Иа на 100 мкг белка, а после электрофореза 0,80 мкг ДДС-На на 100 мкг белка. При этом следует учитывать, что в полиакриламидный гель часть высокомолекулярных белков зеинового комплекса не входит.Таким образом, предлагаемый способ определения гидрофобности белковых компонентов по сравнению с известным имеет следующие преимущества не требует для своего выполнения дорогостоящих приборов и дефицитных реактивов, позволяет определять гидро14515 фобность составных частей гетерогенных белков, более чувствителен. 100 А-В где А и В - количества додецилсульфа"та натрия, связавшегося с первой и второй дорожками соответственно, мкг;С - количество белка в даннойпробе, определенное по окрашиванию третьей дорожки, мкг. Гидро-.фобНпощадьпиков,(вариант б),ДДС-Иа Площадь пиков по вайриантам, мм Группа компо- нентов елок,мкг вязан ость,140 92 0,15 О,00 Составитель А. Семеновактор Л,Веселовская Техред А.Кравчук Корректор М,Демчи Заказ 7073/42 Тир аж .788 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 олиграфическое предприятие, г. Ужгородул. Проектная,водственно Формула изобретения5 Способ определения гидрофобности белков, включающий обработку анализируемых белков родецилсульфатом натрия и связывание метиленового голубого, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью усиления разрешаю-". щей способности и повышения точности анализа, анапизируемые белки предварительно разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле в трех параллельных дорожках, денатурируют три-." хпоруксусной кислотой и первую дорожку инкубируют в 0,14-0,20 мМ растворе додецилсульфата натрия, освобождают гель от избытка детергента фосфатным буфером рН 7,0 и окрашивают 0,002- 0,004%-ным раствором метиленового голубого, вторую дорожку окрашивают 0,002-0,004%-ным раствором метиленового голубого, третью окрашивают 9940,05%-ным раствором кумасси Ки после освобождения гелей от избытка красителейдистиллированной водой интенсивность окраски белков измеряют денситометрированием и по разности оптических плотностей первых двух дорожек судят о количестве связавшегося додецилсульфата натрия с белковой зоной, а по оптической плотности третьей дорожки находят количество белка с последукщим расчетом количест- ва додецилсульфата натрияна единйцу белка согласно формуле