Способ определения целостности ядер в срезах биологической ткани на цитологическом препарате

)4 С 01 Н 33/4 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ТЕЛЬСТВ АВТОРСКОМУ 00766/28-13-иссле оло гии доват ел(53) 5 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(56) Хесин Я.Е. Размеры ядер и Функциональное состояние клеток, М.: Медицина, 1967, с. 7-33.Хруст Ж.Р. и др. Основы количест венной цитохимии. Изд, Моск. универ ситета, 1978, с. 13-18, 31-33.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛОСТНОСТИ ЯДЕР Б СРЕЗАХ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТКАНИ(57) Изобретение относится к биологии, в частности к цитологии и касается идентификации целостностиядер в срезе. Преимущественно изобретение предназначается для определения размеров ядер и Фитофотометрического исследования ДНК ядер в срезах. Целью изобретения является повышение точности способа и его упрощение за счет идентификации целостности ядра. Для этого отбирают пробу исследуемой ткани, Фиксируют ее, обезвоживают, заключают в парафин, готовят микротомные срезы, окрашивают ихпо Фельгену, а затем микроскопируютв фазовом контрасте и по зеленомуцвету ядра судят о его целостности.Изобретение относится к биологии,в частности к цитологии и касаетсяидентификации целостности ядер всрезах биологической ткани. Преиму 5щественно изобретение предназначается для определения размеров ядер ицитофотометрического исследованияДНК ядер в срезах.Целью изобретения является повышение точности способа и его упрощениеза счет идентификации целостностиядра.Способ иллюстрируется следущцимипример ами. 5П р и м е р 1. Кусочки листьевпроростков гшеницы сортов Эммер иБаплади 116 Фиксируют по Карнуа, после чего их обеэвоживают, заключаютв парафин и приготавливают срезы тол щиной 10 мкм общепринятым методом.Депарафинированные срезы окрашиваютпо Фельгену и просматривают под микроскопом ЛЮМАМ-Ив проходящемсвете от лампы накаливания, Все ядра 25имеют одинаковый цвет - сиреневокрасный. При просмотре этих же ядер вфазовом контрасте одни иэ них имеютзеленый цвет, другие - желтый и оранжево-желтый. Применение других кислых и нейтральных фиксаторов, обычно.применяемых для исследования ДНКядер посредством реакции Фельгена,на результат не влияет,Методом послойной реконструкцииудалось установить, что зеленый цветимеют целые ядра, а желтый или оранжевый - резаные, Из 87 ядер идентифи-:цируют 35 как целые и 52 как резаные.Для доказательства установленногоявления применяют еще два методических подхода,Из мезофилла листьев проросткапшеницы выделяют протопласты, гдевсе ядра заведомо целые. После окрас ки по Фельгену выделенных протопластов в суспензии и приготовления мазков препараты просматривают под микроскопом. В проходящем свете всеядра в мазках, как и в срезах,имеют сир енево-кр асный свет, а вФазовом контрасте все ядра зеленые.Так как в мазке все ядра заведомоцелые, то зто подтверждает связь зеленого цвета ядра в Фазовом контрасте с его целостностью.55При помощи винтового окуляр-микрометра в мазках устанавливают средниеразмеры ядер киеток мезофилла листьев пшеницы. Максимальный диаметр ядра:11,50+ 3,80, минимальный 5,40 + 0,01,При используемой толщине среза(10 мкм) ядро такой величины можноразрезать только на две части, Очевидно, что в этом случае средние размеры резаных ядер меньше средних раз"меров целых. На поперечных срезахлистьев пшеницы,используя предлагаемый способ, при помощи винтового окуляр-микрометра производят измерениецелых и отдельно резаных ядер (Р =99 ). Средние размеры целого ядра(9,4110,48) оказались больше, чемрезаного (7,969,21).Данные, полученные в эксперименте, служат основанием для исследования изменения количества лабильнойДНК и размеров ядер в листьях проростков пшеницы, пораженных возбудителем стеблевой ржавчины.П р и м е р 2, Свежую печень белой крысы помещают в 103-ный формалин прио4 С, измельчают на кусочки объемом6 мм, постфиксируют в смеси зтанолзледяная уксусная кислота в соотношении 3;1 в течение 2 ч. Затем обезвоживают, заключают в парафин и приготавливают срезы толщиной 1 О и5 мкм общепринятым методом. Депарафинированные срезы окрашивают пофельгену и просматривают под микроскопом ЛЮМАМ-Ив проходящем светеот лампы накаливания, Все ядра имеют одинаковый цвет - сиренево-красный. Цитоплазма окрашена в розовыйцвет. При просмотре этих же ядер вфазовом контрасте большинство изних зеленого цвета, меньшая частьжелтого, Цитоппазма видоизменяется,приобретая бледно-желтый оттенок,что не мешает четко различать ядракак целые, так и резаные.Для доказательства того, что зеленый цвет в Фазовом контрасте всрезах печени так же, как и в листьяхпшеницы, имеют целые ядра, окрашивают ядра по Фельгену непосредственнов целом кусочке печени и затем изэтого кусочка готовят давленый препарат, где ядра заведомо целые. В таком цитологическом препарате подмикроскопом в проходящем свете всеядра имеют один цвет - снреневокрасный, а цитоппазма - розовый. Вфазовом контрасте ядра зеленого цвета, а цитоплазма по-пр,:,кнему розового,Составитель И.ТарееваТехред А. Кравчук Корректор М.Демчик Редактор Л. Веселовская Заказ 7073/42 Тираж 788 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 з 1451598аДля доказательства того,что реза- печени в фазовом контрасте имеют желные ядра в срезах печени в фазовом тый цвет,контрасте имеют желтый цвет, опреде- Ф о р м у л а и э о б р е т е н и яляют число резаных ядер в срезах тол 5Способ определения целостностищнной 10 и 5 мкм. Очевидно, что в бо-ядер в срезах биологической тканилее тонком срезе должно быть больше на цитологическом препарате, включарезаных ядер, следовательно, в фазо- наций отбор пробы ткани, фиксацию,вом контрасте большинство ядер имеет обезвоживание и заключение ее в пажелтый цвет. Число зеленых и желтых 10 рафин, приготовление мнкротомныхядер определяют при помощи 12-клавиш- срезов, их окрашивание по Фельгенуного счетчика по препарату, выбирая с последукщим определением под светонесколько случайных попей зрения, В вым микроскопом, о т л и ч а ю щ и йпяти полях зрения срезов толщиной с я тем, что, с целью повышения точ 10 мкм в среднем оказалось 24,5 жел ности способа и его упрощения затых ядер, а в срезах толщиной 5 мкм - счет идентификации целостности ядра41,8. Таким образом, уменьшение тол- непосредственно в одном срезе, опрещины среза в 2 раза примерно во столь- деление ведут в фазовом контрасте ико же раз увеличило число резаных по зеленому цвету ядра судят о егоядер. Следовательно, резаные ядра .20 целостности.