Способ внутривидовой дифференциации штаммов стафилококков

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК БО ГОСУД АРС ПО ДЕЛА к д ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР.ЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им, Л.А,Тарасевича (72) Э.А.Берилло и Л.Д. Перемитина (53) 576.8.093. 1(088.8)(56) Справочник по микробиологичесим и вирусологическйм методам иссле ования./Под ред, М.О.Биргера.М,; Медицина, 1982, с. 254, 118-119, (54) СПОСОБ ВНУТРИВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИ АЦИИ ШТАММОВ СТАФИЛОКОККОВ(57) Изобретение относится к медицинской микробиологии. Цель изобретения - повышение точности способа засчет расширения числа типируемых штаммов стафилококков. Для осуществленияспособа дополнительно к Международному набору типовых диагностическихбактериофагов используют три новыхстафилококковых бактериофага Ф,Фи Ф, Для осуществления способа исследуемую культуру засеваютна поверхность плотной среды и нагазон культуры после подсушиваниякапельно наносят типовые фаги. Постепени лизиса стафилококков проводят внутривидовую дифференцию металлов стафилококков. 1 табл.Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при диагностике стафилококковой инфекции.Цель изобретения - повышение точ 5ности способа за счет расширения числа типируемых штаммов стафилококков.Для осуществления способа при фаготипировании наряду с 22-я типовымидиагностическими бактериофагами используют новые штаммы бактериофагов9 413, 729 и 13676,Штаммы стафилококковых бактериофагов выделяют из лизогенных штаммовстафилококков с помощью УФ-индукции,депонированы в Государственной коллекции бактериофагов под номерамиФ, Ф, и Фсоответственно.Фаги К (ф) и Р 729 (Ф) 20формируют мутные бляшки диаметром0,2 - 1,0 мм. Негативные колонии фагаР 13676 (Ф) диаметром 0,5-1,0 ммимеют ясное прозрачное дно. Фаги имеют бинальный тип симметрии,т,е. отно сятся к 1 типу. Фаги Р 413 и 729 имеют цилиндрическую головку, фагУ 1366 - гексагональную, размером950 х 950 А,1При изучении фаз взаимодействия фагов с клеткой хозяина выявлено, чтофаг Р 413 отличается по скорости адсорбции и латентному периоду от фаговР 29 и 13676. Средний урожай на одну бактериальную клетку у фаговВ 413 и 13676 низкий и составляет5,3 и 7,8 частиц соответственно. Фаг9 729 продуцирует 69,5 частиц. Зависимости выхода фага от скорости адсорбции не отмечено. Фаги Р 729 и13676 с константой скорости адсорбции1,6-1,7 х 10 млн/мин в среднем продуцируют разное количество инфекционных частиц (69,5 и 7,8),Материалы изучения основных при"знаков бактериофагов 9 413, 729и 13676 представлены в таблице,Антигенные свойства бактериофаговР 413, 729, 13676. Для изучения антигенных свойств бактериофагов используют антифаговые сыворотки.50Проверка антифаговых сывороток,полученных к каждому из селекционированных фагов в перекрестной реакциинейтрализации с гомологичными, гетерологичными фагами, включая фаги Международного набора различных серологических групп (А,В,Г,1), показывает,что селекционированные фаги отличаются от фагов Международной коллекции,а также между собой, причем в большейстепени это можно отнести к бактериофагу В 13676,Антифаговые сыворотки в перекрестных реакциях нейтрализации используют в разведении, при котором наблюдается инактивация не менее 90% часотиц гомологичного фаза при 37 С втечение 5 мин (рабочий титр),Бактериофаги У 413, 729, 13676лиофилизированы с использованием 5%пептона, сохраняют свои свойства втечение четырех лет (срок наблюде. -ния)Внутривидовую дифференциацию стафилококков осуществляют при использовании коллекции фагов Международногонабора, в которую дополнительно включают фаги Р 413, 729 и 13676, отличающиеся специфическим литическимспектром.П р и м е р, Приготовление фаговдля типирования,Лиофилизированные в объеме 0,1 млбактериофаги В 413, 729 и 13676 стерильно растворяют в 1 мл щелочногобульона Хоттингера (рН 7,6) с 0,4%глюкозы и 0,02% СаС 1 . Из этого разведения (10 ) готовят два рабочихразведения, соответствующие 1-тестразведению (ТР) и 100 ТР и используютих для типирования стафилококков вместе с фагами Международной коллекции.Подготовка штаммов для типирования, Суточную агаровую культуру испытуемого штамма засевают в пробиркус 4,5 мл бульона Хоттингера (рНо7,2-7,4) и выращивают 3-4 ч при 37 С(до появления заметной мути). Одновременно готовят чашки Петри с 1,2% -ным агаром, приготовленным на бульнеХоттингера, с добавлением свежеймясной воды (рН 7,6), добавляют в него 0,4% глюкозы и 10%-ный растворСаС 1 из расчета 0,2 мл на 100 млрасплавленного агара (перед розли-вом чашек), Чашки с агаром после застывания подсушивают 30-40 мин прио37 С и засевают сплошным газоном 34-часовой бульонной культурой, Избыток культуры удаляют пастеровской пипеткой, Чашки подсушивают 30-40 минпри 37 С.Проведение внутривидовой дифференциации стафилококков (фаготипирование). Дно засеянной чашки расчерчивают по 25 квадратов (по числу42 42 Е 47 53 77 83 А 8481 187 54 7585 42 Д 15 реднийрохай фаа набактериКонстантскоростиадсорб"циимлн/мин окапсид кл Периодлизиатентый перфология негбляиек фаг Хозяин во питателв с.антса развиодн а, ин елен стн амет мин рост ткустиц) 0,5 х 10 120 2 0 5,3+О 1 Ч 1200 х 3300 х 10 х 600ТЧ 1200 х 3300 х 10 х 600 0 а 13 Иут 672 0 69517,67 1,7 х 10 80,г-о О 5-1 О Прозрачные 1 Ч 950 х ЗЗООх 20х 950 5 7,807 бх 10 5 13676 533 ВНИИПИ Заказ 6355/ Т Подписно оизв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проект з 14425 фагов: 22 фага Международной коллекции и 3 предлагаемых фага В 413, 729, 13676) и в каждый .квадрат наносят каплю соответствующего фага:5 413 729 13676 29 52 52 А 79 8010ЗА ЗС 55 71 6 Фаготипирование штаммов начинают рабочим разведением фагов (ТР), Штам мы, с которыми получен отрицательный результат, на следующий день типируют повторно первым разведением фагов (разведение 10 ),25Учет результатов типирования. Степень лизиса разными разведениями фага регистрируют по следующей схеме;- сливной (полный лизис); - полусливной лизис (незначительный рост культуры в зоне лизиса); - наличие в месте нанесения капли фага свыше 50 колоний (первые три реакции относятся к учитываемым реакциям и регистрируются одним обозначением ); + - 20 - 50 колоний фага; полное отсутствие лизиса.В случае, если штаммы стафилококка чуствительны только к дополнительным фагам, их фаговариант устанавливают с помощью последних. Например: штам Ф 5371. 1 ТР 729; У 187 1 ТР 413/729/13676 и т.д.Применение стафилококковых бактериофагов 9 413, 729, 13676 вместе с коллекцией фагов Международного набора для дифференциации 98 штаммов стафилококка, выделенных из различного материала при различных формах заболеваний, увеличивает процент дифференцируемых культур в среднем от 46,9 до 865 Е. Использование предлагаемых селекционированных бактериофагов вместе с фагами Международного набора позволяет выявлять источник и пути передачи инфекции, вызванной новыми фаговариантами стафилококка. Формула изобретения Способ внутривидовой дифференциации штаммов стафилококков путем посева исследуемой культуры стафилококков на плотную питательную среду с последующим нанесением на газон культуры типовых диагностических стафилококковых бактериофагов, инкубированием посевов и учетом результатов по степени лизиса культуры, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа за счет расширения числа типируемыхштаммов стафилококков, дополнительно используют штаммы диагностическихстафилококков бактериофагов Ф,Фи Ф.