Способ получения cu, zn-супероксиддисмутазы из животного сырья

(191 (И) 13 3 СЮ 4 С 1 02 А БРЕТЕНИ ТОРСКОМУ С ЕЛЬСТ рмСС акоп Ве а и сравОД иэт.42,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ(71) Институт биохимии АН А(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Си, Еп-СУПЕРОКСИДЦИСМУТАЗЫ ИЗ ЖИВОТНОГО СЫРЬЯ (5) Предлагается способ препаративного выделения из животных тканей (печень, почки, легкие, сердце, мозг) Сц,Еп-супероксиддисмутазы (СОД). Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта, универсальности способа, Изобретение заключается в том, что рН гомогената тканей, полученного смешиванием ацетонового порошка с 0,1 М калийфосфатным буфером,доводят до рН 5-7,при этом нерастворимые части гомогената осаждают центрифугированием при 6000 х я (20 мин)вместо до 20000 х я (40 мин). Затемпроводят осаждение белка сульфатомаммония с добавлением ацетона (двадцатикратно меньшим объемом). В реэультате этого происходит быстрое са"мораэделение белковой фракции с уменьшением объема в 10-12 раз. При этомбелковый осадок собирают центрифугированием при 3000 х я (15 мин) вместо до6000 х я (40 мин) в известном. Даль.фнейшая очистка белка включает обра"ботку ион-обменной хроматографией игель-фильтрацией. Способ дает возможность обрабатывать в лабораторныхусловиях до 30 кг ткани с хорошим выходом (65-672) получения фермента всравнительно коротков время (в течение 3 дней) с использованием несложных оборудований и недорогостоящих -недифицитных реактивов. Причем использованные реактивы (ацетон, ион"обменники, сефадексы) регенерируют, 1413133Изобретение относится к биотехнологии и касается выделения Со,Еп-супероксиддисмутазы (СОД) из печени,почек, легких, сердца и мозга крупного рогатого скота.Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта, упрощение ирасширение Функциональных возможностей способа. 0Способ предусматривает проведение осаждения (удаления) нерастворимых частей гомогената при рН 5,7,так как при этих условиях наблюдается оптимальное осаждение мутности 15(прозрачность супернатанта 1007), Повышение предела рН приводит к частичному осаждению СОД (изоэлектрнческаяточка которой равна 6,1), и неполно"му осаждению мутности (507), а при 20понижении этого предела повышаетсяриск денатурирования СОД, большерасходуется кислоты. Удаление мутности важно тем чтобы уменьшить дегра 925дацию СОД этими веществами, которыепредставляют мембраны и др. (перекиси липидов мембран). При рН 5,5 или 6выход СОД уменьшается примерно на10-127.Количество добавляемого ацетонаподобрано с таким расчетом, чтобыобеспечить полное и быстрое (в течение 20-30 мин) саморазделенне белковой фракции от остальных частей раствора, Это количество ацетона оптималь ное (в 20-кратно меньшем объеме).Добавление ацетона в больших количествах (в 10-кратно меньшем объеме) фактически не влияет на выход полученного препарата и приводит к излишнему расходу этого реактива. При уменьшении количества добавленного ацетона (например, в 30-кратно меньшем. объеме) приводит к неполному и дли-,тельному разделению (в течение 3 ч) 45белковой Фракции,Предложенным способом полученныйпрепарат СОД электрофоретически гомогенный (злефтрофорез проводили на77.-ном полиакриламидном геле, на котором была видна только одна полоса).Дополнительным подтверждением гомо"генности препарата служит критерийчистоты (оптический индекс чистоты):отношение поглощения при 680 нм и 55260 нм, Ао /Лзо 35, Полученныйпрепарат СОД имеет оптические и ЭПРспектры, мол,массу (32000 Да),идентичные препаратам, полученным из других источников, Активность полученного препарата супероксиддисмутазы, определенная по нитротетразолевому синему методу, составляет 3500-3800 ед/мгбелка,Полученный препарат имеет аналогичные формы спектров (свойства) име"ющиеся у Сц, Ка"СОД, полученный другими способами (имеет максимумы по"глощения при 260, 680 нм на оптическом спектре и А 111140 Гс,8 = 2,08 (фактор Панде) по ЭПР-спект.3.рам. Таким образом предложенным способом получается препарат Сц, Еп-СОДс типичными физико-химическими свойствами и активностью.1Выделение СОД осуществляют следуюшнм образом.Ткань в количестве до 30 кг, гомо-;генизируют в двухкратно большем объеме ацетона с помощью раэмельчителейткани при 8000 об/мин в течение 2 мин.Собирают ацетоновый осадок центрифугнрованием при 3000 х я, 15 мин, егогомогенизируют в 0,1 М Фосфатном буфере, рН 7,4 (КФБ) и инкубируют полученную смесь при 10 С в течение2 ч, прн интенсивном перемешивании,.Затем рН этого гомогената приводят к5,7 (0,5 М моляной кислоты) и удаляют нерастворимые части центрифугированием в течение 20 мин при 6000 хх я, К полученному надосадочномураствору добавляют сульфат аммониядо насыщения и затем ацетон (в 20 кратно меньшем объеме), смесь интенсивно перемешивают и оставляют впокое, Через 20-30 мин при 20 Спроисходит полное разделение белко"вой фракции от других компонентовсмеси (белковая фракция в виде агрегата собирается на верхнем слое раствора и легко декантируется). При этомобъем белковой фракции уменьшаетсяв 10-12 раэ (без потери белка), собирают белковый осадок центрифугировванием 3000 х я., 20 мин, растворяютего в воде. Затем удаляют центрифугированием фракцию, осажденную при507.-ном насыщении сульфатом аммония,и собирают СОД-содержащую фракциюпри 907-ном насыщении. После растворения этого осадка в воде ставятдиалиэ против воды (на ночь). Последиализа и удаления нерастворимых частей центрифугированием красно-зеленоватый супернатант пропускают черезколонку с ДЭцеллюлозой (размеры20 хб см), уравновешенную 0,04 М КФБ,рН 7,4. СОД элюирует 0,02 М КФБ иосаждают на колонке с ДЭАЭ Асефадексом (15 хбсм), уравновешеннойэтим же буфером. Далее эту колонкупромывают 0,01 М буфером (1 л) иСОД элюируют 0,2 М буфером. Затем полученный раствор СОД пропускают через сефадекс С(120 х 4 см) и СОД 10(зеленого цвета) концентрируют наДЭцеллюлозе (10 х 3 см).После такой обработки получаютэлектрофоретически гомогенный препарат Сц,2 п-супероксиддисмутазы, Время работ, затраченное на процедурувьделения и очистки СОД составляет3 дня.Способ позволяет обрабатывать ткани фактически в неорганических количествах (в лабораторных условиях до30 кг ткани, при одном выделении) иполучать высокоочищенный препаратСОД, удельная активность которой со-ставляет 3800-4000 ед/мг белка за 25единицу активности принимается то количество белка в мг, которое способно ингибировать на 507 процесс образования формазана при восстановлениинитросинего тетразоля супероксидными 30анионами.Выход чистого препарата СОД сос"тавляет в среднем 65-677 от исходно"го количества СОД в гомогенате. Заодновьделение в расчете на 1 кг ткани предложенным способом можнополучить из печени до 300 мг, почек -200 мг, легких - 90 мг, сердца -80 мг, мозга - 50 мг Сц, 2 п-СОД.П р и м е р, Схема выделения и 40очистки СОД из различных тканей жиЯотного происхождения.1. Печень (30 кг), почки (30 кг), сердце (30 кг), легкие (30 кг), могз(2-кратный объем).2. Гомогенизация ацетонового осадка в 0,1 М фосфатном буфере (3 объем)рН 7,4, Инкубация смеси в течение 2 ч . при 10 фС, 503, Понижение рН гомогената до рН 5,7 с добавлением 0,5 М НС 1 и цент рифугирование при 6000 об/мин, 20 мин.4. Насыщение надосадочного раствора сульфатом аммония и добавление ацетона (в 20-кратно меньшем объеме) и сбор верхнего - белкового слоя,после центрифугирования при 3000 об/мин,20 мин, осадок растворяют в воде.После центрифугирования (6000 об/мнн,30 мин) к полученному надосадочному раствору добавляют сульфат аммония до 907 насыщения и собирают осадок центрифугированием при 6000 об/мини растворяют в воде и ставят диализпротив воды.5. После центрифугирования диалиэата при 6000 об/мин супернатаит пропускают через колонку с ДЭцеллю"лозой (20 хб см), уравновешенной фосфатным буфером (рН 7,4).6, СОД-фракцию (зеленую) элюируют0,02 М буфером (рН 7,4),и пропускаютчерез ДЭАЭ Асефадекс (15 хб см),СОД элюируют 0,2 М буфером,7, Полученный СОД затем пропускают через С(120 х 4 см) и выходящуюСОД концентрируют на ДЭцеллюлозе (10 х 3 см).8. Выход полученного гомогенногопрепарата СОД в расчете 1 кг,Х: печени 67; почки 65; сердце бб; легкие 65; мозг 64; СОД-активность препарата, соответственно ед/мг 3900,.3800, 3800, 3700,3500.Формула иэ обретения Способ получения Са, 2 п-супероксид"дисмутазы из животного сырья, предусматривающий гомогенизацию сырья, вкачестве которого используют печень,почки и мозг крупного рогатого скота,в ацетоне, получение.надосадочногораствора из гомогената, диалиэ про-,тив воды белковой фракции с последующей очисткой ионообменной хроматографией на ДЭ,"ДЭАЭ Ацеллюлозегель-фильтрацией на сефадексах С,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения выхода целевогопродукта, упрощения и расширенияфункциональных возможностей способа,в качестве исходного сырья дополнительно используют сердце и легкиекрупного рогатого скота, величину рНгомогената доводят до 5,7 0,5 М соля"ной кислотой, нерастворимый осадокудаляют, осаждают белок из надосадочного раствора насыщением сульфатоьаммония и добавлением ацетона в двад.цатикратно меньшем объеме,