Способ получения регенерантов протопластов дрожжей sасснаrомyсеs cerevisiae

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЕТЕЛЬСТ У АВ ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ(71) Институт молекулярной биологии и генетики АН УССР(56) ЯчоЪойа А., Несас О. КеяепегаГоп оЕ уеазй ргогор 1 азйз ргерагед Ьу зпад 1 епзуп)е. - Магоге, 1966, ч, 210, Р 5038, р. 845-847.Тегепсзу 1 , Магаз А. Тгапзйег ой шдгос 1)опдг 1 а Ьу ргойор 1 азг Ецз 1 оп 1 п ЯассЬагоп)усез сегечз 1 ае. - 11 агцге, 1977, ч, 268, 9 11, р. 524-525, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГЕНЕРАНТОВ ПРОТОПЛАСТОВ ДРОЖЖЕЙ ЯАССНАКОМУСЕЯ СЕВЕЧ 1 ЯХАЕ(57) Изобретение относится к областибиотехнологии и генетической инженерии, касается .получения регенерантовпротопластов дрожжей ЯассЬагоп)усезсегеч 1 з 1 ае и может быть использовано в генетико-селекционных работахЦелью изобретения является повьппениевыхода регенерантов дрожжевых протопластов, что увеличивает вероятностьотбора клонов дрожжей с нужными генетическими свойствами. Способ заключается в том, что протопласты пере.внесением в регенерационную средупредварительно инкубируют в течение0,5-3 ч в питательной среде УРД, дополненной антиоксидантом 2,6-дитретбутил-метил 6 енолом (ионолом) в концентрации 2-5 мкг/мл. 2 табл.Изобретение относится к биотехно" логии и,генетической инженерии и касается получения регенерантов прото- пластов дрожжей БассЬагошусев сегечХвае и может быть использовано в генетико"селекционных работах.Целью изобретения является повышение выхода регенерантов дрожжевых протопластов, что увеличивает вероятность отбора клонов дрожжей с нужны,ми генетическими свойствами.Способ заключается в том что прО 1 топласты перед внесением в регенерационную среду дополнительно инкуби 5 руют в течение 0,5-3 ч в питательной среде УРД состава, г/л: дрожжевой экстракт Цифко 10, пептон Дифко 15, ,глюкоза 20, сорбит 146, дистиллированная вода 1 л в присутствии антиоксиданта 2,6-дитретбутип-метилфенола (ионола) в концентрации 2- ,5 мкг/мл.Изобретение позволяет повысить вы,ход регенерантов протопластов, что ,увеличивает вероятность отбора клонов дрожжей с нужными генетическими свойствами.П р и м е р 1. Протопласты дрожжей Басспагошусев сегеч 1 вве ЬЬ 20 по,лучают по следующей методике. Клетки дрожжей выращивают в питательной сре,де УРД, содержащейг/л дистиллированной воды: дрожжевая азотная основа Дифко 6,7; пептон Дифко 1 и глюкоза 20, в условиях аэрации среды на качалке (180 качений/мин) до достижения культурой логарифмической Фазы роста (2-4 1 О кл/мл). Из 20 мл культуральной среды клетки осаждают центрифугированием (3000 я, 5 мин), осадок отмывают двумя объемами (40 мл) стерильной дистиллированной воды при центрифугировании в тех же условиях, Отмытый осадок ресуспендируют в 2 мл среды для получения протопластов, содержащей 0,6 М КС 1, 0,1 М КН РО, 0,2 Мйа БОз (рН 7,1), В полученную суспенэию добавляют 01 мл пищеварительного сока улитки. Суспенэию инкубируют при осторожном перемешивании (50 качаний/мин) при 30 С в течение 8"10 мин. Полученные протопласты отмывают два раза пятью объемами 0,8 1 сорбита при центрифугировании (3000 я, 5 мин). Отмытый осадок протопластов ресуспендируют в 20 мл среды УРД, содержащей, г/л; дрожжевой экстракт Дифко 10, пелтон Дифко 15, глюкоза 20, сорбит 146, добавляют 2,6-дитретбутил.-метилфенол (ионол) до конечной концентрации 2- 5 мкг/мл (для сравнения берутся и другие концентрации), причем ионол предварительно растворяют в зтаноле, и смесь инкубируют при медленном перемешивании (50 качаний/мин) в течениео0,5-3 ч при 30 С (суспензия протопластов разбивается на варианты по 1.мл), Затем протопласты центрифугируют, осадок отмывают 5 объемами 0,8 М сорбита в условиях центрифугирования при 3000 к 5 мин. Отмытый осадок прото- пластов ресуспендируют в 0,8 М растворе сорбита из расчета 1 мл раствора на 1 мл исходной суспензии прото- пластов в растворе УРД, и из этой суспенэии делают разведения 1:10000 и 1:100000 (для разведений используют 0-8 М раствор сорбита). Аликвоты разведенной суспензии протопластов (по 0,2 мл) переносят в пробирки, содержащие 10 мл расплавленной агаризованной регенерационной среды следующего состава, г/л: дрожжевая азотная основа Дифко 6,7; глюкоза 20; сорбит 146, агар 20. Для предотвращения застывания агариэованной среды пробирки до использования выдерживают в водяной бане при 43-45 С, После легкого перемешивания содержимое пробирок вылива" ют в чашки Петри (диаметр 100 мм) ио помещают в термостат на 30 . На 2-3-и сутки в толще и на поверхности агара наблюдают выросшие колонии регенерантов.В табл, 1 представлены сравнительные данные по регенерации протоплас" тов дрожжей Басспагошасев сегеч 1 в 1.ае ЬЬ 20, обработанных в течение 1 часа в среде УРД 2,6-дитретбутил-метилфенолом в различных концентрациях.П р и м е р 2. Протопласты дрожжей Басспагошусев сегечв 1.ае СНУ 18 получают и обрабатывают, как в примере 1.Данные представлены в табл. 2 (обработка 2,6"дитретбутил-метилфено" лом проводилась в течение 2 ч).Формула изобретенияСпособ получения регенерантов про" топластов дрожжей БассЬагошусев сеге" чв 1 ае, предусматривающий внеСение протопластов в регенерационную среду с последующим их выдерживанием в нейз 1395674до образования регенерантов, о т - бируют в течение 0,5-3 ч в питательл и ч а ю щ и й с я тем, что, с це- ной среде УНР, в которую дополнительлью увеличения выхода регенерантов, но вводят антиоксидант в виде 2,6-дипротопласты перед внесением в регене-третбутил-метилфенола в концентрарационную среду предварительно инку- ции 2-5 мкг/мл.5 ТаблицаУсловия экспери- Количество промента, концент- топластов врация антиокси мл исходнойданта суспензии Выход протопластов Количество ре 7 от числагенерантов из исходных1 мл исходной протоплассуспензиитов Контроль (безобработки) 3,7 х 10 3,7 х О 3,7 х 10 5,3 х 10 3,2,х 10 3,7 х 10у 6,4 х 10 14 86 2 мкг/мл 5 мкг/мл 20 мкг/мл 100 3,7 х 10 17 4 За 1003 принято количество протопластов в 1 мл исходнойсуспензии. Т а б л и ц а 2 ФВыход протопластов Количество протопластов в1 мл исходнойсуспензии Условия эксперимента, концентрация антиоксиданта Количество регенерантов из1 мп исходнойсуспензии Х от числа исходныхпротопластов Контроль (безобработки) 1,8 х 10 1,8 х 10 18 х 10 5,5 х 10 1,6 х 10 14 х 10 1,0 х 10 3,8 х 10 1 7 х 10 0,5 мкг/мл 2 мкг/мп 78 1,8 х 10 5 мкг/мл 10 мкг/мл 20 мкг/мл 1,8 х 10 1.8 х 1 О ФЗа 003 принято количество протопластов в 1 мл исходнойсуспензии. ВНИИПИ Заказ 2468/27 Тирюк 520 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Уагород, ул. Проектная, 4