Способ приготовления биферментного электрода для определения сахарозы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК А 1 9 ( 51)4 С 1 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ сист ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(56) Кулис Ю.Ю. Аналитические емы на основе иммобилизованных ферментов. Вильнюс: Мокслас, 1981,с. 200.Щеллер Ф. и др. Биоспецифическиесенсоры. " Прикладная биохимия и микробиология, 1982, т. 18, В 4, с. 354,(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БИФЕРМЕНТНОГО ЭЛЕКТРОДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ САХАРОЗЫ(57) Изобретение относится к областианалитической химии, в частности кспособам изготовления ферментных электродов для определения сахароэы в биологических средах, и может быть использовано в медицине, пищевой и микробиологической промышленности. Цель изобретения - упрощение способа и улучшения качества электрода за счет повышения воспроизводимости его характеристик. Способ заключается в следующем; пирографитовый электрод выдерживают в растворе акриламида/ . Б,М -бис-метиленакриламида и глюкозоо-, ксидазы при потенциале (-1,1)-(-,2)В, а затем переносят в водный раствор поливинилового спирта, содержащего борную кислоту и инвертазу и также выдерживают при потенциале (-1,1) (-1,2)В, а затем обрабатывают мембра- ф ну глутаровым альдегидом. Способ позволяет упростить процесс получения электрода, а также улучшить его ка- С, чество за счет повышения воспроизводимости его характеристик. 1 табл.Изобретение относится к аналитической химии, в частности к способам изготовления Ферментных электродов для определения сахарозы н биологических средах, и может быть использовано в медицине, пищевой и микробиологической промышленности.Цель изобретения - упрощение способа и улучшение качества электрода за счет поььппения воспроизводимости его характеристик.Способ осуществляют следующим образом.Пирографитовый электрод выдержива ют в растворе акриламида И,И -бисметиленакриламида и глюкозооксидазы при потенциале (-1,1) - (-1,2)В (относительно водородного электрода в том же растворе), а затем переносят в водный раствор поливинилового спирта, содержащего борную кислоту и инвертазу и также выдерживают при потенциале (-1,1) " (-1,2)В, Время, в течение которого необходимо выдерживать электрод в том и другом растворе, зависит от того, какой толщины мембрану нуж,но получить и может изменяться от 10 с до 3-5 мин. В процессе поляриза ции электрода при данном потенциале на электроде адсорбируется глюкозооксидаза и образуется мембрана из поли, :акриламидного геля, содержащая глюко зооксидазу, включенную в мембрану. В растворе поливинилового спирта, со 35 держащего борную кислоту и инвертазу при катодной поляризации происходит подщелачивание приэлектродного слоя в результате выделения водорода, в результате .изменения рН происходит сшивание поливинилового спирта анионами борной кислоты (тетрагидроксоборат-анионами). Образующаяся мембрана поливинилового спирта содержит инвертазу, включенную в объем мембраны. Мембрана из поливинилового спирта в процессе работы может растворяться, поэтому для повышения ее стабильности производят сшивание глутаровым альдегидом.Методика изготовления электрода упрощается, так как процесс осуществляется в одну стадию, а также повьппается активность и воспроизводимость характеристик электрода благодаря тому, что адсорбируется большее коли чество ферментов, которые равномерно распределяются на поверхности электрода и по толшине мембраны, кроме того, мембрана достаточно тонкая и равномерная по толщине и характеристики ее воспроизводятся от опыта к опыту.Способ иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1. Пирографитовый электрод опускают в ячейку с водным раствором, содержащим г/л: акриламид 350; Б,Н -бис-метиленакриламид 25; хлорид цинка 20; глюкозооксидаза 0,5. На пирографитовом электроде поддерживают потенциал, равный -1,1 В относительно водородного электрода в том же растворе, противоэлектрод - анод используют из пластины или нержавеющей стали. Процесс ведут при комнатной температуре в течение 2 мин. Затем электрод промывают водой и опускают в ячейку с водным раствором, содержащим, г/л; поливиниловый спирт 80;борная кислота 4; инвертаза О,б.Электролитом служит ацетатный буферный раствор рН 5,0. На пирографитовом электроде поддерживают потенциал -1,1 В. Процесс проводят 15 с, После этоГо электрод промывают и помещают в раствор глутарового альдегида для сшивания поливинилового покрытия.Раствор для сшивания содержит0,125 маса% глутарового альдегида и 14,0 мас.% хлорида натрия в воде.Толщина образующейся мембраны в выбранном интервале времени составля ет 25 мкм.П р и м е р ы 2-5. Все операции, как в примере 1, кроме потенциала, при котором проводили получение мембраны на электроде. Потенциал составляет для примера 2 - (1,15)В; 3 (-1,2)В; 4 - ( - 1,05)В; 5 - (-1,25)В.Активность и воспроизводимость характеристик полученных электродов оценивают как по скорости Ферментативной реакции, так и величине тока, отвечающего превращению пероксида водорода, образующегося в результате последовательных реакций.Реакции, протекающие в биферментной системе, могут быть представлены следующим образом:Инвертаза, иммобилизованная во внешнем слое мембраны, осуществляет реакцию превращения сахарозы:инвертазаСахарааа а Н О в в -а Фр 1 хтоза + ы, -Б-Глюкозаз 1395675в результате мутаротации Ы-Э-глюкозапревращается в Р -Р-глюкозу, котораяявляется субстратом глюкозооксидазы,Глюкозооксидаза, иммобилизованнаяво внутреннем слое мембраны, осуществляет окисление глюкозы с образовани 5ем пероксида водорода по реакции: глюкозооксндаза-Р-Глюкоза + Ог + Н О же препятствует образованию мембраны и адсорбции фермента,Характеристики биферментных электродов, изготовленных по предлагаемому способу, сохраняются в течение месяца, что позволяет широко применять их для определения сахарозы в медико- биологических исследованиях.Кроме того, в предлагаемом способе отсутствует стадия закрепления мембраны на электроде, поскольку иммобилизация и закрепление мембраны осуществляются в одну стадию. Формула изобретения Способ приготовления биферментного электрода для определения сахароэы, включающий иммобилизацию глюкоэооксидазы и инвертаэы в мембрану и закрепление мембраны на электроде, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и улучшения качества электрода эа счет повышения воспроизводимости его характеристик, иммобилизацию ферментов и закрепление мембраны проводят одновременно, выдерживая электрод при потенциале (-1,1) - (-1,2) В последовательно в растворе акриламида и Б,Б -бис-мети/ленакриламида, содержащего глюкоэооксидазу, а затем в растворе поливинилового спирта, содержащего инвертазу, а полученную мембрану обрабатывают глутаровым альдегидом. 35 40 Ток,мкА/смгпри Е=0,6 ВАд/АцС 1 ВоспроиэвоСуммарноевремя дляприготовления, мин Активность на основа -Нотенциал поляризадимость характеристик"+, 8, Х нии данныхспектральныхизмерений,А, у.е. ции электрода, В- 1,05 0,08 - 1,1 О 0,32 - 1,15 034 20-25 10-12 10-11 10 5-6 1.2 5-6 Образующуюся Н Ог оценивают спектрофотометрически, добавляя в раствор 10 иодид калия, который окисляется пероксидом водорода с образованием К.1 з. Количество образующего комплекса КЛ определяют при длине волны 350 нм.Величина оптической плотности служит 15 мерой ферментативной активности электрода. Электрохимически активность ферментного электрода оценивают по величине тока, измеренного при потенциале +0,6 В (относительно хлорсеребряного электрода сравнения), отвечающего восстановлению пероксида водорода и пропорционального концентрации сахарозы в растворе.В таблице представлены данные по активности и воспроизводимости характеристик электродов, полученных по предлагаемому и известному способам.Результаты, представленны в таблице, показывают, что электрод, изготав-З 0 ливаемый по предлагаемому способу, имеет более высокую активность и воспроизводимость. Способ проще и быстрее. Снижение характеристик электрода при выходе за область предлагаемых потенциалов обусловлено тем, что при потенциале менее отрицательном, чем -1,1 В полимерные мембраны вообще не образуются, а при потенциалах отрицательнее -1,2 В начинается интенсивное выделение водорода, которое такГлюконовая кислота + Н Ог(прототип) 0,14 28-32 50-60 4.Значения тока измерены через 1 мин после наложения потенциала на электрод в растворе сахарозы в концентрации1 О З М. Приведены средние значения токов для 10 независи".мьх электродов.4 ФВоспроизводимость характеристик оценивали по формуле:гср . 1003Л, получена для 10 электродов данного типа. 1 Составитель В.Иуронец Редактор Т.Лазоренко Техред Л,Сердюкова 1(орректор О,КравцоваЗаказ 2468/27 Тираж 520 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий11.3035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4(5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4