Бромид 3-аллил-5-анилинометилен-4-оксо-2-(2-карбоксиэтилтио) -4, 5-дигидротиазолия, проявляющий антипротеолитическую активность

Изобретение относится к новым био.логически активным химическим соединениям, а именно к бромиду 3-аллил- -5-анилинометилен-оксо-(2-карбоксиэтилтио)-4,5-дигидротиазолия, про 5 являющему антипротеолитическую активность.Укаэанное. свойство предполагает возможность применения этого соедине" 1 О ния и качестве ингибитора протеолитических ферментов н медицине.Целью изобретения является усиление антипротеолитической активности в ряду производных тиаэола. 15П р и м е р. Получение бромида 3-аллил-анилинометилен-оксо- -(2-карбоксиэтилтио)-4,5-дигидротиаэолия (соединение 1).Смесь 2,8 г 3-аллил-анилиномети ленроданина, 1,5 г бромпропионовойокислоты нагревают при 120 С 2 ч, После охлаждения план растирают с ацетоном, продукт отфильтровывают, получают 3,5 г (853) соединения 1, раз лагающегося при нагревании выше 150 С.Найдено, Х: С 45,0; Н 4,0 Вг18,5; М 5,9; Б 15,0.С(а Но ВЮйОз 8 г.Вычислено, Х: С 44,76; Н 3,96; 30Вг 18,65; й 6,53; 8 14,92,Определение токсичности соединения .Проводили в опытах на белых беспородных мышах (1 О штук) массой 18-.20 г.35 Суспенэию вещества в водном растворе крахмала внодили внутрижелудочно через зонд из расчета 300 мг на 1 кг живой массы тела. Наблюдение проводили в течение 2 сут после введения, 40 Результаты наблюдения показали, что. летальный исход не наблюдается ни у одного из экспериментальных животных. Из этого следует, что величина Ыц соединенияпревышает 300 мг/кг,45Изучение антипротеолитической активности.Изучали вопытах 1 п ч 1 тго методом измерения степени торможения реакции гидролитического расщепления каэеина, 50 катализируемой трипсином или химотрипсином.Для определения каэеинолитической активности трипсина использовали метод К.Н. Веремеенко. 55В пробирку на 20 мл добавляли1,5 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,6) и 0,5 мл раствора трипсина в том же буфере (содержание белка 14 мкг/мл) и проводили преинкубацию н течение15 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 1,0 мл 27-ного раствораказеина по Гаммерстену н 0,05 М фосфатном буфере при нагревании на водяаной бане .при 70-80 С в течение 30 минс последующим охлаждением, доведением рН раствора до значения 7,6 спомощью 0,1 н. ЮаОН (контроль величины рН проводили на рН-метре со .стеклянным электродом) и доведением объ- .ема до 100 мл.Инкубацию проводили в течениео15 мин при 37 С на водян,й бане совстряхивателем. По оконч,-.нии инкубацииреакцию останавливали добавлением2 мл 5 Х-ной трихлорусусной кислоты.Через -1,5 ч после окончания реакцииосадок белка отделяли центрифугированием при 1000 я в течение 15 мин иизмеряли оптическую плотность надосадочной жидкости на спектрофотометреСфА при длине волны 280 нм противконтроля, который обрабатывали сходным образом, но 0,5 мл трипсина вно"силн после добавления трихлоруксуснойкислоты.Полученное значение экстинкции Еиспользовали для вычисления ингиби"рующей активности испытуемого вещества.При определении ингибирующей активности испытуемого вещества в опытную пробирку вносили 0,10 мп (О;25,0,5, 1,0, 1,5 мл соответственно) раствора вещества (100 мкг/мл) в 0,05 Мфосфатном буфере (рН 7,6) и тот жебуфер до общего объема 1,5 мл, добавляли 0,5 мл раствора трипсина в том,/же буфере (содержание белка 14 мкг/мл).Далее пробы обрабатывали так же, каки в случае определения казеинолитической активности трипсина, Контрольсодержал те же составляющие, но трипсин вносили после добавления трихлоруксусной кислоты.Степень ингибирования вычисляли по формуле(1-Е )Степень ингибированияЕкгде Е и Е " оптическая плотность вприсутствии испытуемого вещества и без него соответственно.Определение казеиколитической актинности химотрипсина проводили по той же схеме, что и для трипсина, но вместо трипсина вносили 0,5 мл химо1394676 ЕС соединения 1 в реакции трипсин. каэеин меньше таковой для амбена в 112 раэ, соединений 2 и 3 в 10 и 7 раэ соответственно.В реакции химотрипсин - казеин величина ЕС, соединенияменьше аналогичной характеристики амбена более чем в 700 раз, а соединений 2 и 3 - в 91 и 11 раэ соответственно.Таким образом, антипротеолитическая активность соединения 1 значительно выше, чем у его структурных аналогов и базового объекта, что указывает на возможность его применения в медицинской практике значительно . меньших дозировках, т.е. при исполь" зовании снижается вероятность побочных эффектов. трипсина (14 мкг белка в 1 мл 0,05 Мфосфатного буфера, РН 7,6).Сравнивали по активности соединениес аналогом по действию, в качестве которого выбран амбен (и-аминометилбензойная кислота) - препарат,применяемый в медицинской практикекаК антипротеазное средство, а такжес аналогами по структуре " бромидоми хлоридом 4,5-дигидро-карбоксиметилтио-анилинометилен-аллилтиазолия (соединения 2 и Э соответственно), При определении антипротеолити"ческой активности соединений концентрация амбена во вносимом растворе составляла 3 мг/мл, а производныхтиазола - 1 мг/мл,В качестве величины, характеризующей ингибиторные свойства веществ 20. и позволяющей сравнить эти свойствау разных веществ, выбрана величинаЕС , т.е. концентрация вещества, длякоторой степень ингибирования, рассчитанная по приведенной выше формуле, составляет 503, Полученные.данные представлены в таблице,Как видно из представленных в таблице данных, соединениеподавляетказеинолитическую активность трипсина 30и химотрипсина в значительно большей1степени, чем аналоги. Так, величинаАнтипротеолитическая акнияи аналогов по стр Формула изобретения Бромид 3-аллнл-анилинометилен- -4-оксо-(2-карбоксиэтилтио)-4,5-дигидротиаэолия формулыС,НРН-СНоОВСН 2 СН 2 СООНВгСН,СН=СН, проявляющий антипротеолитическую ак-. тивность. тивность соединеуктуре н действию Вещество ЕС в Реакции, мМЮ Ш Щ Ю химотрипснн - каэеин трипсин - казеин Соединение ) 0,065(0,049; 0,08)0,0065(0 э 0058; 0,0072) 4,7(4,6 4,8) 7 юЭ(6",61 8 э 0) Амбен 0,59(0,57; 0,61) Соединение 2 0,66(0,64; 0,68) Соедине 1 ние Э 0,46(0,40; 0,51) . 0,72(0,063; 0,080) Ти аж 325 Подписное ВНИПИ Заказ 1542 Произв.-полигр, пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 П ри м е ч а и и е В скобках приведены значения ЯСполученные в двух. параллельных определениях.