Способ определения лейцинаминопептидазы в биологическом материале

(71) Пер институт (72) А.П (53) 616 (56) Авт Р 111469 1984. ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ОПИСАНИЕ ИЗОБР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕИЦИНАМИНОПЕПТИДАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ(57) Изобретение относится к областбиохимии и может быть использованодля определения лейцинаминопептидазы (ЛАП) в биологическом материалеЦель - ускорение и повышение чувствительности способа. Образец (ликвор, фракции ткани мозга) наносят нахроматографическую колонку с приспособлением для центрифугирования,заполненную сефадексом 6-75, центрифугируют 2 мин при 3000 об/мин, промывают сначала физиологическим раствором, затем 1-47-ным раствором формальдегида для удаления балластныхбелков и центрифугируют 2 мин при3000 об/мин. Далее на колонку наносят 6-9 Х-ный раствор формальдегида,который избирательно элюирует фер-.мент и одновременно активизирует его,оставляют на 30-40 мин при комнат-ной температуре, центрифугируют 2 минпри 3000 об/мин. Специфическая активность целевого продукта подвергается исследованию его активности спомощью ЛАП-теста фирмы "Регшодпоз 1:",Удельная активность ЛАП, выделеннойиз биологических жидкостей и тканимозга, равна 15-30 ед/мг белка.12936Изобретение относится к биохимиии может быть использовано для определения лейцинаминопептидазы в биологическом материале.Цель изобретения - ускорение и повышение чувствительности способа.Способ осуществляют следующим образом,Ликвор (фракции ткани мозга) наносят на хроматографическую колонку сприспособлением для центрифугирования, заполненную сефадексом 6-75,центрифугируют в течение 2 мин соскоростью 3600 об/мин, промывают сначала физиологическим раствором, за 15тем 1-4%-ным раствором формальдегидадля удаления балластных белков ивновь центрифугируют 2 мин со скоростью 3000 об/мин.Далее на колонку наносят б%-ныйраствор формальдегида, оставляют на30-40 мин при комнатной температуреи вновь центрифугируют ее в течение2 мин со скоростью 3000 об/мин.Специфическая активность целевогопродукта подвергается исследованиюего активности с помощью ЛАП-тестафирмы "Регшодпозе".Одновременно в исследуемых образцах проводят количественное определение белка методом Лоури и удельнуюактивность фермента выражают на 1 мгбелка.При этом удельная активность лейцинаминопептидаза (ЛАП),выделенногоиз биологических жидкостей и тканимозга, колебалась в пределах от 15 до30 ед/мг белка.Полученный положительный эффект 40обусловлен выявленным свойством Формальдегида в концентрации от б до 9 избирательно элюировать фермент схроматографической колонки и одновременно активировать его. 45Опытным путем установлена оптимальная концентрация формальцегида -в пределах от. 6 до 9 .1"4%-ный раствор формальдегидасмывает лишь балластные белки, 4 -5 -ный раствор частично элюирует фермент (не более 60 ).При концентрациивыше 9% фермент инактивируется.Время контакта оптимальной концентрации Формальдегида (6-9 ) с сорбированным на колонке Ферментом колеблется в пределах 30 - 46 мин. При инкубации в течении 10 - 25 мин (засчет недостаточной десорбции Фермен 58гта) и при инкубации более 45 мин (за счет инактивации) активность фермента снижалась.П р и м е р 1. Ликвор больного с рассеянным склерозом наслаивают на хроматографическую колонку (с приспособлением для центрифугирования), заполненную сефадексом С, центрифугируют в течение 2 мин со скоростью 3000 об/мин, промывают сначала физиологическим раствором, а затем 1 4%-ным раствором формальдегида для удаления балластных белков и вновь центрифугируют 2 мин со скоростью 3000 об/мин. Далее сорбированный на колонке фермент инкубируют 30 мин при комнатной температуре в присутствии 9%-ного раствора формальдегида с последующим центрифугированием при 3000 об/мин.Удельная активность ЛАП в исходном ликворе О, после инкубации сорбированного на колонке фермента в присутствии 9%-ного раствора формальдегида 30 ед/мг белка,Таким образом, время выделения фермента сокращается до часа по сравнению с 72-96 ч, в известном способе. Одновременно чувствительность способа повышается в 4 раза.Л р и м е р 2. В ткани мозга выделение фермента проводят из грубоочищенных препаратов миелина. Для этого 3,0 г ткани мозга кролика гомогенизируют в присутствии 20 мл 0,32 М сахарозы, наслаивают гомогенат на 0,85 М раствора сахарозы, центрифугируютпри 26000 об/мин в течение 60 мин.ФФракцию миелина суспензируют дву-, мя объемами дистиллированной Н О, центрифугируют 15 мин при 4000 об/мин, Осадок обрабатывают 14 мл физиологического раствора (500-600белка/мл) и полученную суспензию наносят на две хроматографические колонки.В одном случае процедуру выделения проводят аналогично примеру 1. Вторую колонку оставили в холодильнике на 4 дня. Фермент элюировали физиологическим раствором,Удельная активность ЛАП в исходной суспензии миелина 0,03 ед/мг белка, После инкубации сорбированного на колонке фермента в присутствииЗаказ 381/50 Тираж 777 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород,ул.Проектная,4 Формула изобретения Способ определения лейцинаминопептидазы в биологическом материале путем нанесения пробы на колонку, заполненную сефадексом Сс последующим вымыванием балластных белков физиологическим раствором, инкубацией сорбированного на колонке фермена, элюцией фермента с последующимпределением его сгектрофотометрически с помощью субстрата лейцингидразида, о т л и ч а ю щ и й с я тем, 5 что, с целью ускорения и повышениячувствительности способа, балластныебелки дополнительно смывают 1-4 Х-нымраствором формальдегида, а инкубациюпроводят в течение 30-45 мин в присутствии 6-97.-ного раствора формальдегида.