Способ определения реакции организма на воздействие стрессорных факторов

СООЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕаЪБЛИН 9) (Н) А 9 4 с 31 И 33/ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯАВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ У 8 ческой и экспери СО АМН СССР Л.Е.Панин тельство СССР33/48, 1981.(54) СПОСОБНИЗМА НА ВОТОРОВ(57) Изобрене и можетоценки степнизм Фактормер для отб ение относится к медициыть использовано дляни воздействия на оргав внешней среды, наприра лиц, пригодных к рабоГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИИ И ОТНРЫТИЙ(71) Институт клинментальной медицин(56) Авторское свиУ 800879, кл. С О 1 ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕАКЦИИ ОРГА-,ДЕЙСТВИЕ СТРЕССОРНЫХ ФАК-,те в экстремальных условиях, для определения предельно допустимой тренировочной нагрузки у спортсменов.Цель изобретения - повышение точностиспособа. Обследование проводят в период относительного функциональногопокоя и в период интенсивных тренировочных нагрузок. В сыворотке кровиопределяют активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы.Затем сравнивают эти результаты сисходными данными. При повышении активности ферментов на 203 и выше отисходного уровня определяю патологическую реакцию организма, а при по-,вышении активности меньше, чем на20 Ж - нормальную реакцию организма.2 табл.Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки степени воздействия на организм факторов внешней среды, например, для отбора,лиц,йригадных к работе в экстремальных условиях, для определения предельно допустимой тренировочной нагрузки у спортсменов.Цель изобретения - повышение точности способа.Цель достигается тем, что в сыворотке крови наряду с активностью кислой фосфатазы определяют активность катепсина Д и щелочной фосфатазы,15Способ осуществляется следующим образом.Иэ 2-3 мл венозной крови стандартным методом готовится сыворотка, в которой проводят определение активности кислой фосфатазы, катепсина Д20 и щелочной фосфатазы. Активность указанных ферментов можно определять с помощью микрометодов, В этом случае кровь можно взять из пальца с помощью скарификатора.Предлагаемый способ испытан в эксперименте на 50 крысах, В качестве стрессорного фактора применяли физическую нагрузку разной интенсивности и длительности, По степени нарастания мышечного напряжения применяемые нагрузки распределялись следующим образом: 1 - умеренная однократная нагрузка - плавание в течение 35 ч без груза 2 - интенсивная однократ 2 ная нагрузка до утомления .- плавание 3,5 ч с грузом, составляющим 4% от массы тела; 3 - хроническая нагрузка умеренной интенсивности - плавание беэ груза по 1 ч ежедневно в течение 10 дней; 4 - мышечная работы в истощающем режиме - плавание 3,5 ч с грузом после 1 О-дневной нагрузки по 1 ч также с грузом. Контролем служили ин 45 тактные животные.В сыворотке крови биохимическими методами определяли активность маркерных ферментов лизосом (кислой фосфатазы, катепсина Д) и ще 1 очной фосфатазы. Параллельно активность указанных ферментов определяли в тканях печени, сердечной и скелетных мышц,При всех вариантах стресса в исследуемых тканях животных наблюдается активация лизосомального аппарата клеток, выражающаяся в лабилизации лизосомных мембран, повышении активности лиэосомных ферментов, усилении аутофагоцитоза, снижения осмотическойустойчивости лизосои. Степень активации лизосом коррелирует с интенсивностью, длительностью воздействия ис тяжестью состояния напряжения организма, Эти изменения до определенного момента остаются обратимыми ине сопровождаются повреждением лизосом,В сыворотке крови активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы нри физической нагрузке умеренной интенсивности (режиммьппечной работы 1, 2 и 3) как и у интактных животных минимальна.При истощающей физической нагрузке (режим 4 мышечной работы) в исследуемых тканях: появляются признакиповреждения лиэосом и выхода лизосомных ферментов в цитоплаэму, В тканяхпри этом увеличивается активность ищелочной фосфатазы, что свидетельствует о повышении проницаемости наружных клеточных мембран,В сыворотке крови увеличивается активность кислой фосфатазы (на ":"3%), на 30-50% возрастает активность катепсина Д и щелочной фосфатазы.При микроскопическом исследов.нии препаратов из сердца, скелетных мьяц и печени этой группы животных обнаруживаются следующие изменения, В миокарде возникают мелкоочаговые повреждения: кардиомиоцитов. Часть иэ них резко эозинофильна при окраске гематоксилин-зозином, другая - плохо воспринимает красители. При исследовании в поляризованном свете выявлено, что эти изменения связаны с повреждением сократительного аппарата мышечных клеток: контрактурой миофибрилл или их лизосом, Чаще обнаруживается контрактурный тип повреждения с последующим коагуляционным некрозом клеток. При микроскопическом исследовании скелетных мьппц по длине мы-. шечного волокна нередко находят очаги, имеющие небольшую протяженность - 20-30 саркомеров, гомогеиные, восковидные, почти не структурированные, усиленно связывающие как кислые,так и основные красители. Обнаруживаемая в поляризованном свете анизотропия таких участков говорит о контрактурном повреждении сократительного аппарата мышечных волокон. В печени обнаруживаются гиперемия и отек стро 1293 б 57мы, дистрофические изменения гепатоцитов и некроз отдельных клеток.Таким образом, повышение активности лизосомных ферментов и щелочной фосфатазы в сыворотке крови отражает начало цитолиза и появление микронекротических очагов в тканях. На этой стадии изменения еще носят обратимый характер, и состояние ультраструктур в сердце, скелетных мыш цах и печени полностью восстанавливается в случае прекращения нагрузки.Продолжение нагрузки в истощающем режиме ведет к иэъязвлению кожи туловища и хвоста, животные слабеют и погибают, При вскрытии во внутренних органах обнаруживаются множественные кровоизлияния, крупные некротические очаги в печени, поджелудочной железе, почках, миокарде.20Таким образом, наиболее ранними, доклиническими признаками развивающейся стрессорной патологии являются нарушение целостности лиэосомных мембран и увеличение активности лиэосомных ферментов и щелочной фосфатазы в сыворотке крови. Независимо от того, из какого органа, ткани, клеток происходят лизосомные ферменты, попадающие в кровь, повышение их активности в сыворотке крови может служить критерием оценки реакции организма при действии стрессорных факторов.П р и м е р 1, Спортсмен О, 1-й 35 разряд по биатлону, обладает средним уровнем тренированности. Обследован в конце восстановительного периода (состояние относительного функционального покоя) и в период интенсивных тренировочных нагрузок при подготовке к соревнованиям.Берут по 1,5 мл крови из пальца с помощью скарификатора, стандартным ме тодом готовят сыворотку и определяют в ней активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатаэы.Для Определения активности кислой фосфатазы Ор 1 Ял сыворотки инкубируют при 50 37 С в течение часа с 0,5 мл 1,353-ного раствора 3 -глицерофосфата в 0,2 М ацетатном буфере, рН 5,0. Реакцию останавливают добавлением 1,2 мл 103-ной трихлоруксусной кислоты. После . центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин из надосадочной жидкости берут пробу для определения концентрации неорганического фосфора. Активность кислой фосфатазы выражают в микромолях Р, отщеплейного за 1 мин, на 1 л сыворотки. Активность катепсина Д определяют, инкубируя в течение часа при 37 оС 0,1 мл сыворотки .с 0,5 мл 23-ного раствора гемоглобина. Реакцию останавливают добавлением 3 мл 37,-ного раствора трихлоруксусной кислоты. После центрифугирования в надосадочной жидкости определяют концентрацию кислоторастворимых аминокислот и пептидов с помощью спектрофотометрирова- -; ния при длине волны 280 нм. Активность катепсина Д выражают в микро- молях тирозина, отщепленного за 1 мин на 1 л сыворотки. Активность щелочной фосфатаэы.определяют, инкубируяов течение часа при 37 С 0,1 мл сыворотки с 1,0 мл 0,165 Х-ного раствора 4-нитрофенолфосфата натрия в 0,1 М глициновом буфере, рН 10,5. Реакцию останавливают добавлением 10 мп 0,2 н раствора НаОН, спектрофотометрируют при длине волны 420 нм. Активность щелочной фосфатаэы выражают в микромолх 4-нитрофенола, отщепленного за 1 мин, на 1 л сыворотки.В состоянии относительного покоя активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатаэы составляла соответственно 21,7; 10,2;98,4. В предсоревновательном периоде активность укаэанных ферментов достоверно не изменялась и составляла соответственно 20,9; 11,7; 101,3. Электрокардиографическое исследование выявило неполное восстановление сердечной деятельности, что говорит о недостаточном уровне тренированности. Физическая работоспособность удовлетворительная, Таким образом, данные биохимического обследования свидетельству. ют о неполном использовании потенциальных возможностей организма. Рекомендуется оптимизация тренировочного процесса с равномерным, увеличением нагрузок, адекватных функциональным возможностям организма,П р и м е р 2. Спортсмен В., кандидат в мастера по биатлону. Характеризуется высокой степеньютренированности. Прошел психокардиобиохымическое тестирование в конце восстановительного периода (состояние относительного функционального покоя) и при интесивных физических нагрузках в предсоревновательный период.Берут 1,5 мл крови иэ пальца с помощью скарификатора, стандартным методом готовят сыворотку, в которой проводят определение активности кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы с помощью микрометодов. В состоянии относительного функционального покоя активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы соответственно составляла 23,3; 7,2; 104,0 (активность ферментов выражена в микромолях субстрата, расщепленного за 1 мин, на 1 л сыворотки крови). В предсаревновательномпериоде активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы у спортсмена возрастали на 24, 41 и 277 соответственно, что служит основанием для заключения о неадекватности нагрузки функциональным возможностям смортсмена. В этот период с помощью ЭКГ обнаружены признаки снижения сократительной способности миокарда с явлениями гипоксин левого желудочка. Физическая работоспособность не снижена. Таким образомре"зультаты биохимического контроля укаэывают на то, что несмотря на сохра-,нение физической работоспособностиспортсмена, его организм функционально перенапряжен и находится в критическом состоянии, переходном от фиэиологической реакции на нагрузку к патологическим нарушениям. Рекомендуется снизить объем физических нагрузок,оптимизировать тренировочный режим.Возможна фармакологическая коррекцияпутем введения кардиотонических и седативных средств. П р и м е р 3. Предлагаемым способом протестированы 20 чел ., здоровыемужчины в возрасте от 19 до 40 лет,участники экспедиции, состоявшейсяв условиях зимнего Заполярья, Передвыходом в 200-километровый, двадцатидневный лыжныи поход все участникипрошли комплексное медицинское обследование, по данным которого все 20человек признаны практически здоровыми. Помимо обычного врачебного обследования были проведены также две нагрузки степ-тестом, Последние заключались в подъеме на ступеньку высотой 23 см в течение 5 мин с частотой 30 подъемов в 1 мин. Первая нагрузка производилась при температу-ре окружающего воздуха +2 б С, втораяпри +1 ЗфС. В состоянии физиологического покоя и сразу после нагрузки иэ пальца брали с помощью скарификатора 1,5 мл крови, стандартным методом готовили сыворотку, в которой определяли активность кислой фосфатаэы и катепсина Д, используя микрометоды, Таким образом, у всех обследуемых были получены по четыре значения активности каждого из указанных ферментов,В табл.1 показана активность кислой фосфатаэы и катепсина Д в сыворо 1 ке крови у участников экспедиции (И ш).Как видно из табл.1, у группы в целом достоверных изменений активности кислой фосфатазы и катепсина Д при нагрузочных тестах не было. Однако у одного из членов экспедиции (И 19 лет) эти данные были другими.В табл.2 приведена активность кислой фосфатазы и катепсина Д у одного из участников экспедицииЭтот участник очень болезненно переносил трудности похода, уже с 3-годня начал предъявлять жалобы на плохое общее самочувствие, мышечную слабость, головные боли, боли в подложечной области и в правом подреберье, На10-й день был снят с маршрута и с диагнозом язвенная болезнь желудка от-;правлен вертолетом в госпиталь. Та-.ким образом результаты исследованиялизосомных ферментов в сыворотке крови в данном случае показали резкое ееповышение в ответ на нагрузку стептестом как при температуре комфорта,так и при холодовом воздействии. Этиданные должны были послужить основанием для остранения И. от участия впоходе, что позволило бы предупредитьего заболевание,Повышение активности кислой фосфатазыкатепсина Д и щелочной фасфатазы на 207. и более по сравнению сисходным уровнем означает, что организм находится в критическом переходном состоянии между физиологическимии патологическими реакциями, и служитоснованием для принятия мер профилактики, предупреждающих развитиестрессорной патологии.Предлагаемый способ обеспечиваетвысокую достоверность, точность ичувствительность и позволяет своевременно решать вопросы защитных, профилактических или лечебных мероприя1293657 Таблица 1 оПри температуре +13 С оПри температуре +26 С фермент Нагрузка Покой Нагрузка Покой Кислая фосфатаза 75,3 ф 8,4 85,3+11,023,0+ 2,0 76,7+9,023,4 ф 1,8 76,0+9,2 24,2+3,2 Катедсин Д 25,5+3,7 Таблица 2. оПри температуре +13 С фермент Нагрузка Покой Нагрузка Покой Кислаяфосфатаза 59,2 88,0 88,0 93,5 1483 1583 1483 1007 Катепсин 44,6 44,0 44,4 28,2 156 Х 1567 1557 1007. Составитель А.Рыбина Редактор В.Ковтун Техред А.Кравчук Корректор Г,РешетникЗаказ 381/50 Тираж 7771 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5производственно-полиграфическое предприятие,г.ужгород,ул.Проектная,4 тий. Способ может быть применено для регуляции тренировочного режима спортсменов, летчиков, космонавтов, для разработки оптимального режима труда и отдыха операторов диспетчерских служб, для профотбора лиц, при. годных для профессиональной деятельности в экстремальных условиях. Кроме того, способ может быть использован в экспериментальной медицине и 10 биологии при исследовании механизмов стресса для определения фазы перехода положительного адаптивного эффекта стрессорных воздействий в повреждающий.15 формула изобретенияСпособ определения реакции организма на воздействие стрессорных факторов путем определения активности . кислой фосфатазы в крови до и после их воздействия, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа, в сыворотке крови на" ряду с активностью кислой фосфатазы определяют активность катепсина Д и щелочной фосфатазы и при повышении активности ферментов на 20 Х и выше от исходного уровня определяют пата. логическую реакцию организма, а при повышении активности, меньше чем на 203 - нормальную реакцию организма,