Способ а. л. ямпольского определения с-реактивного белка в крови

Союз Советских Социалистических РеспубликЗависимое от авт. свидетельстваЗаявлено 06.Х 1.1958 ( 611341/31)с присоедшгепием заявкил, 427, 3/54 МП Г 1 р пор птетОпубликовано 31 Х.1967, БюллетеньКомитет пе делам кзоОретвний и открыти при Совете министров СССРУДК 615.47:612,118. та опубликования описания 7.И 11.1967 Авторизобрете А. Л. Ямпольск Заявител СПОСОБ А, Л, ЯМПОЛЬСКОГООПРЕДЕЛЕНИЯ С-РЕАК 1 ИВНОГО БЕЛК ВИ 2 О Предлагаемый способ определения С-реактивного белка в крови дает возможность улучшения диагностики заболеваний с наличиемвоспалительных и некротических явлений.Отличительная особенность способа заключается в том, что С-реактивный белок определяют с помощью иммунной сыворотки, полученной путем иммунизации кроликов внутривенно раствором С-реактивного белка, выделенного нз плевральпого гили перитонеального) экссудата больных лимфогранулематозом с использованием для его изоляции СХполисахарида,Для микроопределения С-реактивного белка предусматривается применение капиллярной реакции преципитации с использованиемнабора, содержащего микроцентрифугу Шкляра на два гнезда, капилляры со штативомдля них, микропробирки для центрифуги иштатив к ним, иглу и флакончик с иммунной 20сывороткой.Способ осуцгествляется следующим образом,Плевральный или перптонеальный экссудатот больного лимфогранулсматозом проверяют 2и реакции кольцеирецнпитации с растворомСХ-полисахарида 1:100000. В качестве контроля употребляют тот же экссудат, в которыйпредварительно добавляют 2 - 3 капли 0,1 Мраствора цитрата натрия па 1 л.г экссудата и 3 тот же раствор СХ-полисахарида, Если в опыте образуется преципитат, а в контроле он не образуется, то экссудат можно брать в работу. 2 л экссудата, положительно реагирующего с СХ-полисахаридом, оставляют в холодильнике на 2 дня при 2 - 8"С. Выпавший в осадок фибрин удаляют центрифугированием. Добавляют 1 л водопроводной воды и хорошо высушенный сульфат аммония по 313 г на 1 л разведенного экссудата, Хорошо перемешивают и, спустя несколько минут после полного растворения, осадок удаляют фильтрацией через несколько бумажных пли полотняных фильтров.На каждый литр фильтрата добавляют по 175 г сульфата аммония и через несколько минут после растворения выпавший осадок отфильтровывают на бумажные диски в воронках Бюхнера с прокладками из бумажной массы с помощгио водоструйного насоса. Лепешки альбуминов снимают с бумаги ножом и растворяют в минимальном объеме дистиллированной воды. Раствор освобождают от груоых обрывков бумаги фильтрацией через ват 1 о-марлевый фильтр, который хорошо отжимают, и еще раз фильтруют через фарфоровую сьсчу.Ультрафильтрат помещают в стерильный целлофановый мешок и подвергают днализу в течение 48 час в 4,г 0,01%-ного хлористогокалия. Выпавший в мешке осадок выделяют центрифугированием и растворяют в 50 - 100 мл 0,1 М раствора цитрата натрия. Охлажденный раствор помещают в колбу, добавляют равное ему количество охлажденного хлороформа, погружают колбу наполовину в сосуд с мелко наколотым льдом, осторожно встряхивают 15 мин в шюттель-аппарате и центрифугируют.В центрифужных пробирках смесь разделяется на 3 фазы: солевую верхнюю, гелеобразную среднюю и хлороформную нижнюю. Отсасывают верхнюю солевую фазу и снова добавляют в колбу равное ей количество хлороформа, Повторяют процедуру встряхивания и отсасывания, Наслаивают солевую фазу на равное количество хлороформа и оставляют в холодильнике на 18 час. Смесь центрифугируют и отсасывают солевую фазу, которую затем подвергают диализу в течение 18 час в растворе 0,85%-ной поваренной соли и 0,01%- ного хлористого кальция. В диализующемся растворе (в мешке) осадок не должен образовываться.К раствору добавляют СХ-полисахарид, предварительно растворенный в небольшом объеме физиологического раствора (до финальной концентрации 0,15 мг/ял), и помещают его в термостат при 37 С на 2 час, а затем в холодильник на 12 - 18 час. После этого раствор центрифугируют. Осадок промывают три раза раствором 0,85%-ной поваренной соли и 0,01%-ного хлористого кальция, каждый раз разрыхляя стеклянной палочкой, Промытый осадок растворяют в 10 - 15 мл 0,1 М раствора цитрата натрия. Малые количества нерастворимого материала (если таковой будет) удаляют центрифугированием.Последний раствор содержит очищенный С-реактивный белок и может употребляться для иммунизации. Концентрацию С-реактивного белка в растворе определяют следующим образом: сначала в небольшом объеме раствора (0,2 мл) опредечяют азот по Кьельдалю, а затем полученную величину его в милли- граммах умножают на коэффициент 7,81.Целесообразно иммунизировать одновременно нескольких кроликов (8 - 12) весом от 3 до 4,5 кг, которым вводят внутривенно по 1 - 1,5 мл раствора С-реактивного белка от 0,5 до 0,75 мг белка при каждой инъекции. Одновременно с первым внутренним введением кролику в несколько симметричных мест под кожу живота вводят 2 - 3,5 мл полезной эмульсии, содержащей 1 мг С-реактивного белка. Через 7 дней после последнего внутри- венного введения антигена кролики тотально обескровливаются из сонной артерии. Сыворотку консервируют мертиолатом 1:10000 и оставляют в холодильнике на 1 - 2 недели, после чего центрифугируют для удаления выпавшего осадка и сливают в одну посуду до окончания проверки,Проверку иммунной сыворотки производят путем определения максимальной преципити Предмет изобретения 50 55 60 1. Способ определения С-реактивного белка в крови, отличающийся тем, что, в целях улучшения диагностики заболеваний с наличием воспалительных и некротических явлений, С-реактивный белок определяют с помощью иммунной сыворотки, полученной путем иммунизации кроликов внутривенно раствором С-реактивного белка, выделенного из плеврального (или перитонеального) экссудата больных лимфогранулематозом с использованием для его изоляции СХ-полисахарида. 2. Применение по способу 1 капиллярной реакции преципитации с использованием наоора для микроопределения С-реактивного белка, состоящего из микроцентрифуги Шклярующей силы и титра, для чего из раствора С-реактивного белка готовят объемные растворы, чтобы иметь следующие его концентрации в мг/мл: 0,3; 0,1; 0,03; 0,01; 0,001. Реак ции преципитации ставят в капиллярах, Максимальной преципитирующей силой сыворотки будет то наибольшее количество преципитата в капилляре в миллиметрах, которое образуется в эквивалентной зоне при концентра цип С-реактивного белка от 0,1 до 0,03 мг/м г.Допустимой максимальной преципитирующей силой должны считаться пределы от 4 до 8 мм.Для проверки на отсутствие перекрестныхреакций с сыворотками здоровых людей за готовляют лиофилизированную сыворотку от20 доноров, у которых в день взятия крови из.меряют температуру, определяют РОЭ, лейкоцитоз и лейкоцитарную формулу. При наличии любых жалоб на недомогание, повышения 20 температуры или изменения крови доноры отвзягия крови отстраняются. В дальнейшем при наличии проверенной иммунной сыворотки против С-реактивного белка, реакция сыворотки донора с ней также должна учиты 25 ваться.Лиофильная сушка сыворотки здорового донора должна производиться не позже, чем на следующий день после взятия крови. Для постановки реакции лиофилизированные сыво ротки разводятся в день исследования и 20контрольных реакций преципитации с иммунной сывороткой против С-реактивного белка ставятся в капиллярах. При отсутствии положительных реакций сыворотка признается год ной к употреблению и разливается во флакончики по 1 мл и снабжается этикеткой: иммунная сыворотка против С-реактивного белка.Титр, дата, серия.Если имеется хотя бы одна положительная 40 реакция, целесообразно добавление в общийобъем антисыворотки сухой нормальной сыворотки по 0,05 г на 1 мл. После экспозиции в термостате при 40 С в течение двух суток антисыворотка освобождается от выпавщего 45 преципитата центрифугированием на большихоборотах, после чего разливается во флаконы,Заказ 2382/14 Тираж 535 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССРМосква, Центр, пр. Серова, д. 4 Типография, пр. Сапунова, 2 ра на два гнезда, капилляров, штатива для капилляров, микропробирок для центрифуги,штатива к ним, иглы и флакончика с иммунной сывороткой.