Способ определения мутагенной активности химических соединений

(50 САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ тем инкуба соединений ной фракци ров хими сомаль паратами и последующим внеьную тест-культу- а селективной в среде, о т л и -м, что, с целью сением в бару, выращивотношении мучающий растений и учного центргериал то А. Еремина те но фект овышени и и точнос препарат микрочени предваритполиамидных гр ал фракции пебилиэуют на торые после створами со ого альдеги 1 а 11 оп Веьно имм улах, к отаны р глутаро 347.ПЕНИЯ МУТАГЕНКИХ СОЕДИНЕНИЙ человека пуовательно обра иной кислоты и ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(46) 23,09,86. Бюл, У (71) Институт экологииживотных Уральского наАН СССР (72) Р. А. Пшеничнов,и В. В. Сергеев (53) 575.113(088 е 8) (56) Апця В. М. е 1 а 1 веагсЬ,. 1975, ч, 31, р (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕ НОЙ АКТИВНОСТИ ХИИИЧЕС в отношении животных и55 12Изобретение относится к генетике, в частности к способам определения мутагенной активности химических соединений, и может быть использовано для прогноза генетических последствий загрязнения окружающей среды, для оценки потенциального мутагенного эффекта лекарственных веществ, для отбора высокоэффективных мутагенов, используемых в селекции, а также для оценки других видов биологической активности (например, бактерицидной, цитостатической, антимутагенной, радиозащитной) химических соединений.Цель изобретения - повышение эффективности и точности способа.П р и м е р 1, Определение мутагенной активности циклофосфана после метаболической активации дп чего иммобилизованной микросомальной фракцией 8-9 сразу после ее получения.Микросомальную Фракцию 8-9 получают центрифугированием гомогената печени кур (9000 д., 60 мин).3 г полнамидных гранул промывают 300 мл дистиллированной воды при 60 С, инкубируют с 200 мл 3 М НС 1 при той же температуре в течение 2 ч при интенсивном перемешивании на маг" нитной мешалке. Гранулы отделяют фильтрованием, промывают дистиллированной водой до рН 7,0 и инкубируют 20 ч с 200. мл.12,5 Ж-ного раствора глутарового альдегида при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Активированный носитель отделяют фильтрованием, промывают дистиллированной водой до отсутствия запаха глутарового альдегида и 500 мл 0,02 М К НРО - КН РО-буфера; рн 7,2.Отмытые гранулы ресуспендируют в 35 мл того же буфера, вносят 5 мл препарата микросом с общим содержанием белка 45 мг, инкубируют 1 чопри +4 С и осторожном перемешивании, Вносят 16 мкл 25 Ж-ного водного раствора глутарового альдегида и инкубируют 60 мин при той же температуре. Гранулы отделяют Фильтрованием, промывают 0,02 М К НРО - КН РО 4 -буфером, рН 7,2, По 1 О мл 0,02 М К НРО КН РО 4-буфера (рН 7,2), содержащего 0,5-5 мг/мл циклофосфана, 3,4 мг/мл МдС 1 и 1,38 мг/мп НАДФ Н, объединяют с полученными гранулами, инкубиру 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 ют в течение часа при постоянном встряхивании. Гранулы отделяют раствора фильтрованием через мембранный фильтр. Полученный фильтрат объединяют с бактериальной вэвесью Яа 3.шопен.3.а ИрИшигЬцпз, штамм ТА 1535 и вносят в чашки Петри, содержащие минимальную среду с добавлением агара до 1,57. Чашки Петри помещают в термостат и инкубируют при 37 С в течение 48 ч после чего подсчитывают количество колоний. Количество мутантов увеличивается по сравнению со спонтанным в зависимости от концентрации внесенного циклофосфана в 17- 19 раз.П р и м е р 2. Определение мутагенной активности циклофосфана после метаболической активации п чСго иммобилизованной фракцией 8-100 сразу после ее получения.Микросомальную фракцию печени кур получают центрифугированием(9000 д., 60 мин). Затем подвергают ее центрифугированию (105000 д 60 мин), супернатант отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 0,15 М растворе КС 1,Условия получения активированного носителя и иммобилизации препарата микросом идентичны описанным в примере 1, за исключением того, что все манипуляции производят при ОуС и на иммобилизацию вносят 2 мл препарата микросом с общим содержанием белка 36 мг.По 10 мл раствора, содержащего 0,5-5 мг/мл циклофосфана, 2,84 мг/мл МаС 1 и 1,16 мг/мл НАДФН, объединяют с полученными гранулами, инкубируют в течение часа при непрерывном встряхивании. Дальнейший ход определения идентичен описанному в примере 1.Количество мутантов увеличивается по сравнению со спонтанным в зависимости от концентрации внесенного циклофосфана в 19-21 раз.П р и м е р 3. Определение мутагенной активности циклофосфана после метаболической активации 1.п; чЫго повторно используемым препаратом иммобилизованной фракции 8-9, хранившейся с момента первого использования в течение 7 сут при +4 С. Условия получения препарата иммобилизованной фракции и тестирования активности идентичны описанным в примерах 1 и 2, за исключением того,1258829 Составитель А. МакаровРедактор Н. Егорова Техред М.Ходанич Корректор Т, Колб Заказ 5087/25 Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 что препарат с момента получения и первого использования до повторного использования сохраняют ресуспендированным в 0,02 М К НРО, - КН РО -аб цф ре, рН 7,2, при +4 С в течение 7 сут. Чувствительность способа определения мутагенной активности снижается на 407, но остается достаточной для обнаружения мутагенной актив ности циклофосфана.