Способ промышленного изготовления очищенного и концентрированного (адсорбированного) столбнячного анатоксина

Класс ЗОВ, б121909 СССР ОБРЕТЕ ОПИСАНИЕ К АВТОРСКО У СВИДЕТЕЛЬСТВ екочихина, Г, С. СойкиЛ. И, Могильникова К, И. Матвеев, Т. В. Орешкина, Е. А Л. Н. Стовичек, Н, В. Хатунцев ПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ИЗГО И КОНЦЕНТРИРОВАННОГО ( СТОЛБНЯЧНОГО АТОВЛЕНИЯ ОЧИЩЕННОГОДСОРБИРОВАННОГО)АТОКСИНА Заявлено 27 мая 1955 г за576762/31 в, Олубликовано в Бюллетене изоб инистерство здравоохоанения СССРетений16 за 1959 г. Известны способы промышленного изготовления очищенного и концентрированного столбнячного анатоксина.Предлагаемый способ дает возможность получения высокоактивного столбнячного токсина. Это достигается тем, что используют гидролизатную (безмясную) питательную среду, приготовленную на основе смеси кислотных гидролизатов казеина, рыбокостной и кукурузной муки, и адаптированный к этой среде штамм столбнячной палочки Колле Ю 8, полученный в результате выращивания при 35 на протяжении 6 - 10 суток, токсин переводят в анатоксин обычным способом обработной формалином, а затем очищают и концентрируют комбинированным осаждением растворами хлористого натрия н соляной кислоты с последующей адсорбцией на гидроокиси алюминия н дальнейшей обработкой и использованием готового анатоксина по известным схемам.Способ осуществляется следующим образом.Приготовление кислотного гидролизата казеина. 8 кг сухого казеина растворяют в 100 л водопроводной воды; к этому раствору добавляют 1 кг концентрированной чистой соляной кислоты, уд. в. 1,18. Смесь перемешивается и нагревается до 80, вторично перемешивается и кипятигся 20 мин., после чего производят гидролиз при 1 птр давления в течение 20 мин.Приготовление кислотного гидролизата рыбной муки и кукурузы.10 ке рыбной муки и 3,3 кг размолотой кукурузы суспендируют в 100 л водопроводной воды, добавляют 1,3 кг концентрированной соляной кислоты, перемешивают и ведут гидролиз в течение 4 час, при давлении 1,5 тл.Кроме гидролизата из рыбной муки и кукурузы готовят гидролизаты из одной рыбной муки по такой же прописи.Из указанных гидролизатов готовятся среды с 40% гидролизата казеина и рыбо-казеиновая среда по следующим прописям.Приготовление казеиновых сред с кукурузным экстрактом. Берут 40% гидролизата казеина, добавляют 56% воды, тщательно перемешивают и нагревают до 80. Добавляют 3% кукурузного экстракта и 0,4 Чо поваренной соли, смесь доводят 20%-ным раствором щелочи до рН 7,2 и кипятят 5 мин. После кипячения рН доводят до 7,2 и добавляют по 0,1% НРОи КНРО, перемешивают и кипятят 10 мин, Фильтруют в горячем виде. Стерилизуют среду при 0,5 атя. в течение 30 мин.Среды К 20 и К 10 приготовляют аналогично тому, как готовят среду с 40% гидролизата казеина с той лишь разницей, что в одном случае берут 20% гидролизата (К 20) и в другом 10% гидролизата по описанной прописи.Приготовление рыбо-казеиновой среды.Берут 20/о гндролпзата рыбной муки и 5% гидролизата казеина, добавляют 71"о воды, перемешивают и нагревают до 80. Добавляют 3% кукурузного экстракта и 0,4 о МаС, смесь доводят 20%-пым раствором ХаОН до рН 7,2 и кипятят 5 мин. После кипячения рН доводят до 7,2 и добавляют по 0.1"о Ха 2 НРО и КНРО 4 перемешивают и кипятят 10 мин. Фильтруют в горячем виде. Среда стерилизуется при 0,5 атм. в течение 30 мин.Химический состав по азотистым компонентам в казеиновых средах отличается от рыбо-казеиновых сред по количеству нерасщепленного белка. В среде с 40% гидролизата казеина нерасщеплепного белка почти и двое больше по сравнению с рыбо-казеиновой средой,Приготовление нативных столбнячных анатоксинов на безмясных средах,Путем адаптации штамма столбняка Колле8 к казенновым средам получают штамм, дающий на казеиновых средах с 40% гидролизата токсин, активностью 500 тыс. - 1 млн. в 1 лл, а на рыбо-казеиновой среде от 1 до 4 млн. в 1 лл. Максимальная сила столбнячного токсина на этих средах наблюдается на 6 - 10 день культивирования. Возраст посевного материала от одних суток до 2 лет. Выращивание производится при 35 С.Полученные токсины переводят в анатоксины путем добавления 4% формалина и выдерживания в термостате при 38. Полное обезвреживапие анатоксинов на 40% гидролизата казеина и рыбо-казеиновой среде происходит за 10 - 13 дней.Столбнячные анатоксины, приготовленные на безмясных средах, подвергались концентрации и адсорбции. Для концентрации столбнячного анатоксина применен метод осаждения анатоксина однонормальным раствором в изоэлектрической точке. Непосредственно перед осаждением нативный анатоксин сепарируют для удаления из него микробных тел. К прозрачному раствору апатоксина добавляют 15% сухой поваренной соли при непрерывном помешивании раствора. После полного растворения соли осторожным добавлением соляной кислоты рН понижают до 3,5. Осажденный анатоксин оставляли в комнате (температура 20 - 22) на 16 - 18 час. Образовавшийся осадок отделяют на центрифуге или сепараторе от маточного раствора и растворяют в фосфатном буфере (рН 7,40) из расчета 25 - 30-кратной концентрации по объему. РН полученного концентрата в зависимости от серии и среды колеблется в пределах 6,50 - 4,20.В тех случаях, когда при растворении осадков в фосфатном буфере рН сдвигается ниже 5,20, растворение осадков бывает неполным, что210 Щ- 3 -приводит к снижению антитоксиносвязывающей способности концентрированного препарата. Поэтому в таких случаях рН раствора доводят 5 й МаОН до 6,3 - 6,50. Добавление щелочи производят по каплям при непрерывном помешивании раствора, так как влияние щелочи без соблюдения осторожности может снизить активность препарата.Раствор концентрированного анатокспна центрифугпруют для удаления из него нерастворившегося осадка балластных веществ, а затем подвергают стерилизующей фильтрации.Для ангтоксинов, приготовленных на среде с 40% гпдролпзата, казеина пользуются непосредственным осаждением однонормального рас- твора соляной кислоты при рН 3,5 без предварительного добавления поваренной соли, что совершенно исключается для анатоксинов, приготовленных на рыбо-казеиновой среде.Метод дает возможность получать при 30-кратной концентрации по объему 10-, а иногда и 16-кратную концентрацию анатоксина по активности, т. е, антитоксинсвязывающей способности нативного анатоксина в 0,03 мл, антитоксинсвязывающая способность концентрированного анатоксина равняется 0,003 ил. Процент выхода концентрированного анатоксина колеблется в пределах ЗЗ/о - 66% до стерилизующей фильтрации (в большинстве случаев 33%) и от 25 до 54% после стерилизующей фильтрации (в большинстве 25%). Снижение % выхода после фильтрации объясняется количественными потерями анатоксина при фильтрации, Антитоксинсвязывающая способность после фильтрации ни в одном случае не снижается.Приготовленные нативные и концентрированные анатоксины подверггпот адсорбции на гидрате окиси алюминия. Концентрированные столбнячные анатоксины наиболее полно адсорбнруются (в среднем 70,) в слабокислой зоне при рН 5,0 - 5,3. Количество добавляемой суспензни А 1(ОН) составляет 50 - 60%, Для нативных столбнячных анатоксинов наиболее подходящими условиями для адсорбции (80 - 100% адсорбции) является значение рН 5,0 - 5,6 и 10 - 15% добавляемой суспензии гидрата окиси алюминия. Адсорбция проводится при комнатной температуре в течение 1 часа. Как нативные, так и концентрированные анатоксины одинаково адсорбируются на А 1(ОН) з, независимо от среды.Предмет изобретенияСпособ промышленного изготовления очищенного и концентрированного (адсорбированного) столбнячного анатоксина, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью получения высокоактивного столбнячного токсина, используют гидролизную (безмясную) питательную среду, приготовленную на основе смеси кислотных гидролизатов казеина, рыбокостной и кукурузной муки, и адаптированный к этой среде штамм столбнячной палочки Колле8, полученный в результате выращивания культуры (при 35 на протяжении 6 - 10 суток), токсин переводят в анатоксип обычным способом обработкой формалином, а затем очищают и кон. ценчрируют анатоксин комбинированным осаждением растворами хлористого натрия и соляной кислоты с последующей адсорбцией на гидро- окиси алюминия и дальнейшей обработкой и использованием готового анатоксина по известным схемам.