Способ получения экстрагента холестерина

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1)4 А 61 К 3/О ЕНИЯ ЬиЮ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) 2-й Московский ордена Ленина государственный медицинский институтим. Н. И. Пирогова(56) 1. Бородин Е. А., Добрецов Г. Е.,Карасевич Е. И. и др. Влияние встраиванияи выведения холестерина на вязкость липидного бислоя и скорость окислительныхпроцессов в мембранах микросом печеникрысы. 1981, Биохимия, т, 46, в. 6, с. 1109 -11 8,2. Рогпапз 1 су М. т. СгесапзЖу 5. СЬо 1 ез 1 его 1 гпочегпеп 1 Ье 1 юееп Ьцгпап зйп 1 Ьго 1 ецзапг рЬоврЬо 1 ЫусЬо 1 пе чеяс 1 ев. ВосЫппсает ВюрЬувса азта. 1982, ч. 680, р, 182 - 180.3. Ко(ЬЬа б, Н., РЬ 111 рз М. С. МесЬа.пзгп о 1 сЬо 1 езегое ейцх 1 гогп се 1 з. еИесзоассер 1 ог з 1 г цс 1 ц ге а п с сопсеп 1 га 1 оп. -(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАГЕНТА ХОЛЕСТЕРИНА путем смешивания фосфатидилхолина и детергента, отличаощийся тем, что, с целью повышения емкости по холестерину, суспензию, содержащую 1 мас. ч. фосфатидилхолина из соевых бобов, 0,1 - 0,4 мас. ч. смеси полипропиленгликоля и полиэтиленгликоля с мол. массой 2000 - 9000 в массовом соотношении 1 - 9: :1 - 4 и 0,002 - 0,04 мас. ч. цетилтриметиламмонийбромида, при содержании фосфатидилхолина 10 - 35 мг/мл облучают ультразвуком при 0 - 4 С в течение 1 - 10 мин.Изобретение относится к медицинской химии, а именно к способам получения экстрагентов, обладающих способностью извлекать холестерин из мембран липопротеидов крови, форменных элементов крови (эритроцитов, тромбоцитов) и клеток стенки кровеносных сосудов.Известен способ получения липосом из фосфатидилхолина яичных желтков в качестве экстрагента холестерина из мембран микросом печени. Согласно способу экстра. - гент получают облучением яичного фосфатидилхолина ультразвуком с последующим центрифугированием для удаления недиспергированного фосфатидилхолина 1 .Известен также способ получения экстрагента холестерина из мембран фибробластов кожи в виде липосом из яичного фосфатидилхолина 2,Недостатком липосом из фосфатидилхолина яичных желтков как экстрагента холестерина является их небольшая емкость по холестерину и низкая стабильность, в результате чего при хранении липосомы необратимо аггрегируют и выпадают в осадок.Известен способ получения экстрагента холестерина путем смешивания фосфатидилхолина и детергента в виде смешанных мицелл фосфатидилхолина яичных желтков и натриевой соли таурохолевой кислоты, заключающийся в растворении фосфатидилхолина яичных желтков и таурохолата натрия в метаноле при соотношении фосфатидилхолин: таурохолат 1:2, упаривании метанола, добавлении забуференного водного раствора и интенсивном перемешивании до просветления 3.Недостатком известного способа является низкая емкость получаемого экстрагента по холестерину, а также выраженное токсическое действие солей холевых кислот, являющихся жесткими анионными детергентами, на биологические мембраны,14 ель изобретения - повышение емкости экстрагента по холестерину.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения экстрагента холестерина путем смешивания фосфатидилхолина и детергента суспензию, содержащую 1 мас. ч. фосфатидилхолина из соевых бобов, 0,1 - 0,4 мас. ч. смеси полипропиленгликоля и полиэтиленгликоля с мол. массой 2000 - 9000 в массовом отношении 1 - 9:1 - 4 и 0,002 - 0,04 мас, ч. цетилтриметиламмонийбромида при содержании фосфатидилхолина 1 О - 25 мг/мл облучают ультразвуком при 1 - 4 С в течение- 10 мин.Пример. В круглодонную колбу объемом 500 мл помещают 5 г фосфатидилхолина соевых бобов, добавляют 50 мл диэтилового эфира, закрывают колбу пробкой и перемешивают содержимое до полного растворения фосфатидилхолина, Диэтиловый эфир упаривают на роторном испарителе при 40 С,5 1 О 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 55 Приливают к содержащемуся на стенках колбы фосфатидилхолину 200 мл водного раствора, содержащего 1 г смеси полипропиленгликоля (ППГ) и пол иэтиленгликоля (ПЭГ) (массовое соотношение 9:1) с мол. м.2000 и 0,05 г цетилтриметиламмонийбромида. Смесь ППГ и ПЭГ в соотношении 9:1 (мол. м, 2000) выпускается фирмой Серва (ФРГ) как неионный детергент Плюроник 1.-61. Кроме детергента Плюроник 1.-61 при производстве экстрагента могут быть использованы аналогичные ППГ и ПЭГ - Плюроник 1.-61 (соотношение ППГ:ПЭГ= =3:2, мол. м. 3000) и Плюроник Г(соотношение ППГ:ПЭГ=1:4, мол. м, 9000). При использовании указанных детергентов класса Плюроник могут быть получены экстрагенты, извлекающие большие количества холестерина и имеющие меньшую токсичность, чем известные.Таким образом, смеси ППГ и ПЭГ могут иметь мол. м. 2000 - 9000, а соотношение ППГ и ПЭГ возможно 1:9 - 1:4. Иные детергенты на основе ППГ и ПЭГ с отличным соотношением ППГ и ПЭГ не выпускаются промышленностью.Интенсивно перемешивают содержимое вплоть до полного отделения фосфатидилхолина от стенок колбы и его солюбилизации. Образующуюся мутную жидкость молочного цвета переносят порциями по 20 мл в стеклянные стаканы на 50 мл, которые помещают в водяной бане со льдом, и воздействуют ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе дробно по 30 с с перерывами в 1 мин до получения прозрачной опалесцирующей жидкости. Общее время воздействия ультразвука 5 мин. Полученную жидкость центрифугируют при 20.000 Кд в течение 15 мин с целью удаления кусочков металла, попадающего с наконечника ультразвукового дезинтегратора. Полученный экстрагент ампулируют под током азота и хранят в ампулах объемом 1 О мл при 0 - 4 С.Полученный экстрагент имеет положительный заряд и содержит 25 мг фосфатидилхолина в 1 мл. Массовое соотношение фосфатидилхолина смеси полимеров и цетилтриметиламмонийбронида 1:0,2:0,01. Экстрагент имеет положительный заряд и извлекает ЗОЯ холестерина п чго из мем. бран эритроцитов в следующих стандартных условиях. Соотношение тени эритроцитов: экстрагент по фосфолипиду 1:2, время инкубации 3 ч, температура 37 С, состав инкубационной среды 100 мМ трис-НС буфер, рН 7,4, 0,5 мл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА); 3 мг фосфолипида теней эритроцитов; 6 мг фосфолипида экстрагента; объем инкубационной смеси 3.5 мл. При исследовании острой токсичности экстрагента на белых мышах - самцах весом 16 - 18 г при внутрибрюшном способе введения экстрагента 1.0 м составляет 90 мкл/г веса животного.1 183118 10 15 20 Таблица 1 Смешанные мицеллы яичного фосфатидилхолина итаурохолата натрия (прототип) Липосомы Положительно заПоказатели из яичного фосфатидилхолина (аналог) ряженные мицеллысоевого фосфатидилхолина(. 0,020,05 П р и м е ч а н и е: Р - достоверность различий между предлагаемымспособом и аналогом, между прототипоми аналогом. Р - достоверность различиямежду предлагаемым способом и прототипом. Таблица 2 ХС/ФЛэритроцитовмоль/моль ХС/ФЛ тромбоцитов моль/мольОбщий ХС/ЛВП-ХС Площадь стенки Группыживотных ЛВП-ХС аорт, покрытаяотложениями ипидов Опытнаяп=7 О, 66 + О, 07 О, 92 +О, 09 6,1+0,6 14+ 2,5 Контрольнаяп=7 0,82+ 0,08 0,99 + 0,08 11+ 1,3 34 4,3 В табл, 1 приводятся сравнительные данные по извлечению холестерина из мембран эритроцитов кроликов экстрагентами на основе фосфатидилхолина, получаемыми согласно предлагаемому способу, прототипу и аналогу.В табл. 2 приводится отношение ХС/ФЛ в мембранах эритроцитов и тромбоцитов, индекс атерогентности и площадь стенки аорт, занимаемая отложениями липидов в опытной и контрольной группах животных.Экстрагент вводят крол икам - самцам породы Шиншилла весом 2,5 - 4 кг с экспериментальным атеросклерозом. Контрольная группа животных находится в режиме спонтанной регрессии экспериментального атеросклероза. Экстрагент вводят животным внутривенно медленно в течение месяца по 3 - 4 инъекции в неделю в общей дозе на одного животного, равной 200 мл экстрагента. Об извлечении холестерина из биологических мембран при введении экстрагента судят по уменьшению отношения холестерин/фосфолириды (ХС/ФЛ) в мембранах эритроцитов и тромбоцитов, индекса атероген ности.Общий ХС - ЛВП - ХСЛВП - ХСи площади стенки аорт, за нимаемой отложениями липидов у животных, получавших экстрагент по отношению к животным контрольной группы. Результаты свидетельствуют, что получаемый по предлагаемому способу экстрагент способен извлекать холестерин из мембран эритроцитов, тромбоцитов, липопротеидов крови и клеток стенки кровеносных сосудов при внутривенном введении животным с экспериментальным атеросклерозом.Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать экстрагент на основе фосфатидилхолина, обладающий повышенной емкостью по холестерину и способный извлекать холестерин как 111 аго, так и 1 П ЧПО.