Способ получения фаголизосомальных структур фагоцитирующих клеток

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для получения внутриклеточных органелл.Известен способ получения фаголиэосомальных структур фагоцитирующих клеток путем получения клеток, смешивания их с инкубационной средой, содержащей фагоцитнруемый материал, проведения фагйцитоза с последующим разрушением клеток и выделением фаголизосомальных структур Ц .,Однако известный способ не позволяет получать в достаточном количестве высокоочищенные препараты.Целью изобретения является повышение чистоты и выхода целевого продукта.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения фаголиэосомальных структур фаго. цитирующих клеток путем получения клеток, смешивания их с инкубационной средой, содержащей фагоцитируемый материал, проведения фагоцитоза с последующим разрушением клеток и выделением фаголизосомальных структур, в качестве фагоцитируемого материала используют частицы карбонального железа диаметром 1-5 мкм в количестве 20-50 мг на 100 10 фагоцитирующих клеток с пос 6ледующим отделением фаголизосомальных структур из разрушенных клеток с в постоянном магнитном поле с нап ряженностью 406-1000 Э.П р и м е р . Фагоциты получали промыванием брюшной полости мышей СВА средой Игла с 0,2-ным бычьим сывороточным альбумином и 20 ед. гепарина/мл. Клетки осаждали центрифугированием в течение 8 мин при 1200 об/мин при 1=0 - 4 СПосле этого осадок ресуспендировали в этой же среде без гепарина и вновь центрифугировали в том же режиме. Монослой клеток получали путем их инкубации при 37 С в течение б 0 мин в атмосфере 5 СО 2 в среде Игла, содержащей 5 инактивированной телячьей эмбриональной сыворотки и 10 мМ НЕРЕЯ (рН 7, 2). Неприлипшие клетки удаляли 3-кратным промыванием монослоя раствором Хенкса, количество прилипших клеток определяли на инвертированном микроскопе, к монослою клеток добавляли карбониальное железо, опсонизированное нормальной мышиной сыворт кой, из расчета 34 мг на 100 10 клеток. Фагоцитоз проводили в течение 60 мин при 37 С в атмосфере 5 СО в вышеназванной среде. Нефагоцитированные частицы карбонильного железа удаляли 3-кратным промыв"нием монослоя клеток раствором Хенкса,клетки снимали с чашек кисточкой, осаждали при 1200 об/мин в течение 8 мин при Т=ОС, ресуспендировали в среде выделения, содержащей 0,25 М сахароэу и 10 мМ НЕРЕЯ (рН 7,2) и разрушали в гомогенизаторе.Полученный гомогенат с помощью перистальтического насоса пропускали в магнитном поле, задержанный на магните материал промывали средой выделения, собирали и подвергали энэимологическому анализу. Напряженность магнитного поля составляла 400 Э. Исследовались активности 5-нуклеотидазы (маркер плазматической мембраны), кислой фосфатазы(лизосомальный маркер) и лактатдегидрогеназы (марнер цитозода). Полученные данные представлены в таблице. Представленные данные указывают, что предложенные процедуры позволяютв один этап в магнитном поле получать фракцию, обладающуюспецифической ферментативной активностью маркеров плазматической мембраны и лизосом, более чемв 10 раз превышаюшую эту актив ность в исходном гомогенате. Этосвидетельствует о том, что получаемая в магнитном поле фракцияпредставляет собой фаголизосомальные структуры фагоцитирующих клеток.4 О По активности же лактатдегидрогеназы одного из ферментов, протекающегов цитозоле гликолиэа, можно судитьо загрязненности выделяемых структурнеразрушенными фагоцитами. В пересчете на общую активность такое загрязнение составляет меньше 1.Использование способа позволяетзначительно повысить чистоту получаемых фаголиэосомальных структур.В предлагаемом способе загрязнениесоставляет меньше 1, тогда как визвестном оно достигает 5, Возра-стает количество получаемых фаголизосомальных структур, так как импридаются специальные характеристики, коренным образом отличающиеих от других клеточных органелл.Кроме того, упрощается весь процессвыделения,который представляет впредлагаемом способе только деление 60 материала в магнитном поле.1141338 Специфическая активность Отношениеактивностей Фермент Фракция Гомогенат фракция гомогенат 0,74 + 0,17 7,88 ф 0,94 3,10 ф 0,47 0,28 + Ор 05 Лактатдегидрогеназа 0,87 + Оу 08 3,150,04 0,17 5-Нуклеотидаза и кислая фосфатаза даны в мкМ Р /ч мг; лактатдегидрогеназа в Фе/мг Составитель Е.ЖитниковаРедактор А.Шишкина Техред М.Пароцай Корректор С,Черни Филиал ППП Патентф, г.ужгород, ул.Проектная, 4 5-НуклеотидазаКислая фосфатазаЗаказ 489/33 Тираж 897 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д,4/5