Способ выделения и очистки бактериальной надн-дегидрогеназы

(54)(57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИБАКТЕРИАЛЬНОЙ НАДН-ДЕГИДРОГЕНАЗЫ путем культивирования штамма-продуцента в питательной среде с последующей дезинтеграцией полученной биоЯО 1136479 А массы, экстракцией и хроматографической очисткой .целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью получения НАДН-дегидрогеназы холерного вибриона, в качестве штамма-продуцента используют холерный вибрион штамм 569 8, дезинтегрирование проводят в смеси с кварцевым песком, полученный дезинтегрант заморакивают при минус 18-20 С в течение 18-24 ч, оттаивают при, комнатной температуре, центрифугируют при 8000-10000на холоду, надосадочную жидкость пропускают через колонку с сейадексом С опри температуре 4-6 С и элюируют целевой продукт 0,01 М К/Ма фосфатным бу - фером рН 7,7-7,9.Изобретение относится к областимикробиологии и касается полученияНАДН-дегидрогеназы из микроорганизмов.Известен способ выделения и очистки бактериальной НАДН-дегидрогеназы,например М,1 узос 1 еЖСсцз, путем культивирования штамма-продуцента в питательной среде с последующей дезинтеграцией полученной биомассы, экстракцией и хроматографической очисткой целевого продукта (13.Однако известный способ не обеспечивает получение НАДН-дегидрогенаэы холерного вибриона.15Целью изобретения является получение НАДН-дегидрогеназы холерноговибриона,Эта цель достигается тем, что вспособе выделения и очисткибактери Оальной НАДН-дегидрогеназы путемкультивирования штамма-продуцентав питательной среде с последующейдезинтеграцией полученной биомассы, экстракцией и хроматограйической очисткой целевого продукта в качестве шгамма-продуцента используютхолерный вибрион штамм 569 В, дезинтегрирование проводят в смеси скварцевым песком, полученный дезинтегрант замораживают при минус",8-20 С в течение 18-24 ч, оттаивают при комнатной температуре, центрифугируют при 8000-10000на холоду, надосадочную жидкость пропускают 5через колонку с сефадексом Спри6температуре 4-6 С и элюируют целевой продукт 0,01 М К/Иа Фосфатнымбуфером рН 7,7-7,9,П р и м е р. В качестве продуцента используют холерный вибрион классического биовара, серовара Инабаштамма 569 В, который хранится вколлекции музея живых культур института "Микроб". Культуру штамма-проду оцента выращивают при 34-36 С в течение 10 ч в 250 л реакторе-Ферментере в условиях аэрации глубинным методом на бульоне из Лерментативногогидролизата казеина рН 8,0, содержа Ощего 200 мг 7. аминного азота, 2 пептона 0,5 Х ИаС 1, Оу 05 Е ИаРО 4 . Бульон-ную реакторную культуру холерноговибриона инактивируют 0,67 формалина, время экспозиции 16-18 ч. Отделение бактериальных клеток проводятпроточным центрифугированием при10000-12000. Биомассу подвергают механической дезинтеграции путем растирания ее в смеси с кварцевым песком в течение 30 мин (на одну часть биомассы берется семь частей кварцевого песка). Дезинтегрированные клетки холерного вибриона отделяют от кварцевого песка декантацией. Разливают небольшими порциями в кол-. бы объемом по 0,5-1,0 л на 18-24 ч помещают в низкотемпературный рефрижератор при минус 18-20.С для замораживания. Затем замороженный дезинтеграт вынимают из рефрижератора и оставляют при комнатной температуре на 5-6 ч. При, оттаивании образуется нерастворимый гелеобразный осадок (флокулят) и жидкая Фракция. Нерастворимый осадок отделяют центрифугированием при 8000- 10000в течение 30-40 мин при 1-2 С, Полученную при этом прозрачную опалесцирующую надосадочную жидкость (уже частично освобожденную от белково-нуклео-полисахаридных компонентов) очищают с помощью гельхроматографии. Хроматографическую колонку размером 50- 2,0 см, имеющую систему охлаждения, наполняют сефадексом 6-200, На гель сефадекса наносят надосадочную жид - кость, содержащую НАДН-дегидрогеназу. В качестве элюирующей жидкости используют 0,01 М К/Иа-Лосфатный буфер рН 7,7-7,9. Элюцию Фермента проводят со скоростью 21 мл/ч. Фракции объемом 5/б мл собирают на автоматическом коллекторе. Каждую Фракцию испытывают на содержание белка (по поглощению длины волны 280 нм и более точно по методу Лоури) и на активность НАДН-дегидрогеназы. Все операции по выделению НАЛН-де гидрогеназы проводят на холоду при 4-6 С и под контролем определенияоудельной активности Фермента, Активность НАДН-дегидрогеназы определяют спектрофотометрически по скорости восстановления 2,6-дихлорфенолиндофенола (2,6-ДФИ) в инкубационной смеси, состоящей из 0,00012 М НАДН-Ма 0,00012 М 2, 6-ДФИ и О, 5 М трис-НС 1 буфера рН 7,6,0 скорости восстановления2,6-ДФИ судят по снижению оптическойплотности инкубационной смеси пос"ле добавления ферментного препаратачерез 30 с в течение 3 мин. Оптическую плотность определяют при длине волны 600 нм. Активность НЛДН136479 4ности ферментного препарата к концентрации белка в нем рассчитывают удельную активность фермента. дегидрогеназы выражают в условныхединицах. За условную единицу принимают то количество фермента, которое способно понизить оптическуюплотность инкубационной смеси на0,01 цены деления шкалы спектрофотометра СФза 1 мин. Путем отношения НАИН-дегидрогеназной активВеличина удельной активности НАДН-дегидрогеназыхолерного вибриона на различных этапах выделенияи очистки Удельнаяактивностьусл/ед/мг СтепеньочистБелок, мг/мл Активность,усл.ед. Статистический,Этап выделения ки показатель Исходный препарат(дезинтегрантбиомассы 71 Ъг 1 осЬо 1 егае 569 В)п=4 33 +7,96 10 +2,17 0,32 +0,05 Мв 8,2 10,56 21-,0 И 67 2,35 Т Оф 2 7 в 3 М+ш Второй этап выделения (хроматография на сефадексе . ф) п=10 2,17+ 0,33 12,3+1,74 5,7 й 0,4 17,8 М+ш 0,44 0,002(0,001 Из 100 г биомассы вибриона классического биовара, серовара Инаба штамма 569 В получают 1, 12 г. ферментного белка. НАДН-дегидрогеназа обладает антигенными н иммуногенными свойствами,Корректор М.Демчик Редактор О.Филиппова Техред С.Мигунова Заказ 6646/4 Тираж 524 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и.открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Подписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Первый этап выделения (замораживание и оттаиваниедезинтегранта)п=10 Результаты определения удельной НАДН-дегидрогеназной активности на всех этапах выделения фермента представлены в таблице. 0,009 0,002 ( 0,001 что позволит использовать данный .препарат для конструирования вакцины.40 Использование способа позволяетпростым методом получить ферментный препарат НАДН-дегидрогеназу холерного вибриона высокой степени очистки.