Способ получения конъюгированных антигенов

(5 в А 61 К 39/О ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ сН А ВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ ПОСОБ ПОЛУЧЕНИ НЫХ АНТИ ГЕНОВ ри рН 8 - 9, отличи ью упрощения процес имодействие морфина ого носителя и фе соотношении 1:(2 - 1(54) (57) ГИРОВАН морфина что, с цел вляют вза го бел ко калия при Я КОНЪЮна основе юи(ийся тем, а, осущеста нти генноррицианида О):1.(71) Научно-исследовательский институт по биологическим испытаниям химических соединений(56) 1. бгоз 5.,1., бгапЮ,1. Р., вопд Я.й., Яс 1 нПег К., Опппцпосйепиз 1 гу, 1974, р. 11, 453 в 4.2. Ковалев И. Е., Полевая О. Б., Башарова Л. А., Шайров В. В. Ковалентное связывание морфина с белком для получения антител, нейтрализующих токсическое действие морфина. Химико-фармацевтический журнал. 1977,5, 12 - 15. ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯИзобретение относится к иммунохимии, а именно к способу получения конъюгированных антигенов морфин-антигенный носитель, которые могут найти применение в медицине и биологии для получения антител к морфину и родственным ему соединениям, нейтрализации их токсического и фармакологического эффекта, а также для определения опиатов в жидкостях и тканях организма.Известны способы получения конъюгированных антигенов .морфин-антигенный носитель, согласно которым обычно получают реакционноспособное производное морфина, которое затем ковалентно связывают с антигенным белковым носителем, например сывороточными белками.Известен способ получения конъюгированных антигенов на основе морфина путем сочетания морфина с диазониевой солью п-а минофенилацетамида, выделения полученного азопроизводного морфина и гид ролиза его с получением морфиназофениламина, который затем с помогцью производного карбодиимида ковалентно связывают с бычьим сывороточным альбумином. Полученный конъюгированный антиген выделяют известными способами 1.Недостаткам такого способа являются его многостадийность и трудоемкость.Наиболее близким к предлагаемому является способ получения конъюгированных антигенов на основе морфина, предусмат ривающий взаимодействие морфина с монодиазотировапным бензидином с выделением полученного производного, его диазотированием и связыванием с антигенным белковым носителем при рН 7 - 9. Обычно в качестве антигенного белкового носителя З используют бычий сывороточный альбумин и соотношение производного морфина и белкового носителя составляет 1:(2 - 10) 2.Недостатками этого способа являются длительность и трудоемкость процесса полу п чения конъюгированных антигенов на основе морфина. Реакционноспособное производное морфина получают в несколько стадий, при этом исходная молекула морфина значительно изменяется за счет введения дополнительных химических группировок, что в дальнейшем сказывается на специфичности антител. Необходима также стадия выделения и очистки промежуточных производных, применение в ходе синтеза растворителей, концентрированных солей и ще-лочей, а также токсичных веществ (бензидин) . Цель изобретения - упрощение процесса получения конъюгированных антигенов.Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения конъюгированных антигенов на основе морфина при рН 8 - 9 осуществляют взаимодействие морфина антигенного белкового носителя и феррицианида калия при соотношении 1: С 2 - 10):1.В предлагаемом способе конъюгированный антиген морфин-антигенный носитель получают в одну стадию. В реакцию связывания с антигенным носителем вступает реакционноспособное производное морфина-соответствующий феноксирадикал морфина, который образуется при взаимодействии морфина с феррицианидом калия.Способ осуществляется следующим образом.Водный раствор хлоргидрата инкубируют с равным весовым количеством феррицианида калия в присутствии раствора бычьего сывороточного альбумина в течение 1-2 ч при рН 8 - 9 и 0-25 С при соотношении морфин: антигенный носитель: феррицианид калия 1: (2 О):1.Полученный конъюгированный антиген морфин-антигенный носитель отделяют от низко молекулярной фракции гель-фильтрацией на сефадексе 6-25. Содержание морфина в синтезированном конъюгированном антигене определяют по разнице введенного в реакцию и непрореагировавшего морфина известным способом. В зависимости от соотношения исходных реагентов получают конъюгированные анти гены, в которых с одной молекулой антигенного носителя (бычьего или человеческого сывороточного адьбуми на) ковалентно связаны от 1 до 20 молекул морфина. Структура полученных конъюгированных антигенов подтверждена данными УФ-спектров, в которых по сравнению со спектром исходного белка увеличивается интенсивность поглощения и смегцение максимума за счет присоединившихся к белку молекул морфина.Соотношение исходных компонентов (1:10:- 1;2:1) в реакции конъюгирования выбрано в таких пределах, что получают коньюгированный антиген оптимального качества, т. е. содержащий от 11 до 20 молекул морфина на молекулу белка. При меньшем количестве морфина в конъюгированном антигене ухудшаются его антигенные свойства, при замещении большем, чем 20 молекул морфина на моль белка, ухудшается растворимость конъюгированного антигена. Выбранный интервал рН (8 - 9) позволяет проводить реакцию с достаточной скоростью при стабильности белкового антигенного носителя. В предлагаемом способе по сравнению с известным достигается значительное упрощение технологии (проведение технологии в одну стадию, без очистки и выделения промежуточных продуктов, исключение целого ряда реактивов и растворителей, убыстрение процесса примерно в 20 раз), Это стало возможным в результате ис23704 Составитель О. Скородумова Техред И. Всрес Корректор М.,соитюк Тираж 687 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 415 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4Редактор И. КасардаЗаказ 803618 пользования друтого приема получения реакционноспособного производного морфина и другого типа реакционноспособного производного.Установлено, что антигенные свойства полученного продукта не уступают свойствам конъюгированных антигенов, полученных известным способом. Пример 1. К раствору 1 О мг феррицианида калия в 0,5 мол воды добавляют раст вор О мг хлоргидрата морфина в 1 мл воды и раствор 100 мг бычьего сывороточного альбумина в 2 мл воды. Полученную реакционную смесь выдерживают в течение 2-х ч при 25 С, поддерживая рН 8 добавлением 1 Оо/о-ного раствора гидроокиси натрия. Реакционную массу хроматографируют на колоннах с сефадексом Сзи сооирают белковую фракцию. Спектрофотометрически устанавливают, что в конъюгированном антигене морфин-бычий сывороточный аль бумин с одной молекулой белка ковалентно связаны 11 молекул морфина.Пример 2. По указанной методике при использовании в качестве антигенного носителя человеческого сывороточного альбумина получают конъюгированный антиген морфин-человеческий сывороточный альбумин, в котором с одной молекулой альбумина ковалентно связаны 13 молекул морфина.Пример 3. К раствору 10 мг феррициани да калия в 0,5 мл воды добавляют раствор 10 мг хлоргидрата морфина вмл воды и раствор 20 мг бычьего сывороточного аль бумина в 2 мл воды. Полученную реакционную массу выдерживают при 10 С в течение 1 ч, поддерживая рН 9 добавлением 1 Оо/о-ного раствора едкого натоа. Реакционную массу хроматографируют на колонках с сефадексом 6-25 и собирают белковую фракцию. Спектрофотометрически устанавливают, что в конъюгированном антигене 40 морфин-бычий сывороточный альбумин с одной молекулой белка ковалентно связаны 20 молекул морфина,Пример 4. По указанной методике при использовании в качестве антигенного носителя человеческого сывороточного альбу- мина получают конъюгированный антиген морфин-человеческий сывороточный альбумин, в котором с одной молекулой белка ковалентно связаны 22 молекулы морфина.Антигенные свойства конъюгированного антигена морфин-белок, полученного в примере 1, исследовали на кроликах. Для этого 5 кроликов массой 2 кг иммунизировали конъюгированным антигеном морфин-белок внутримышечно по 25 мг 1 кг 2-3 раза в неделю в течение 6 недель аналогичным образом проводилась иммунизация и в известном способе). В сыворотке крови животных определяли наличие антител к морфину реакцией пассивной гемагглютинации и торможения пассивной гемагглютинации, как и в способе-прототипе. Было установлено, что в сыворотке крови иммунизированных кроликов имеются антитела на весь конъюгированный антиген, причем их титры были высокими и составляли в зависимости от индивидуальности животного 1:2560-1: 10240. При введении в реакционную среду морфина в концентрации ОМ, титр антител снижается до 1:28 - 1:256. Следовательно, полученный конъюгированный антиген морфин-белок обладает антигенными свойствами, так как он индуцирует у животных синтез антител, специфичных к морфину.Антигенные свойства полученного конъюгата не уступают, а даже в некоторой степени превосходят анти генные свойства конъюгата, полученного в известном способе, так как там были получены титры антител на весь конъюгат 1:2560, а при добавления морфина он снижается до 1:320.Технико-экономическая эффективность от,использования предлагаемого изобретения заключается впрощении процесса получения конъюгированны; анти генов на основе морфина, который проводится в одну стадию и не требует использования такого токсичного вешества как бензидин.