Способ получения реагента для проведения реакции агглютинации

АЗ 316 УБЛИН 9/0 ПИСА ИЗОБРЕ Н ПАТЕН 0,88. Бюл; К биси Кемикал 8 стриз нитсу Суд чо 1. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫ(7 2) Сатоси Тсутсуйи Митио Ито (.ТР)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАГЕН ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНА (57) Изобретение касается ме.в частности иммунохимических реаг.,.тов . Цель изобретения - повышениечувствительности реагента. Для этогочаСтицы носителя, составляющие частьрейгента, размером 0,052-1,2 мкм сенсибилизируют антигеном или антителомЧастицы носителя, сенсибилизированныеантигеном или антителом, перед суспедированием в водной среде обрабагывают стабилизатором, включающим амико"кислоты, белки, полипептиды, не осаждающиеся в иммунологической реакцииагглютинации. Водная среда с рН 5-10,в которой суспендируют носитель, имеет электропроводность 5,0 мс/см иИзобретение относится к иммунохимическому реагенту, и может быть использовано в медицине, биохимии, гигиенеи эпидемиологии при анализе следовыхколичеств соединений, особенно анти 5генов и антител.Дель изобретения - повышение чувствительности реагента.Способ осуществляется следующим .образом.Частицы носителя, которые составляют часть реагента по данному изобретению, представляют собой частицыпрактически .нерастворимые в воднойсреде, Такие частицы носителя могутбыть изготовлены из любого подходящего соединения, которое включает всебя латексы таких полимерных соединений, как полистирол, бутадиенстирольный сополимер, полиакрилат,полиметакрилат, сополимер акрилонитрила с бутадиеном и стиролом, латексы этих полимеров, активированные введением карбоксильных или амидных групп с помощью сополимеризации с акриловой кислотой,метакриловой кислотой, акриламидом и т.п.клетки крови, такие бактерии, какстафилококки и стрептококки, зеггайце шатсезсепз, риккетсии, а такжечасти этих бактерий.Средний диаметр частиц носителейравен от 0,05 до 1,2 мкм или от 0,1 до1,00 мкм, предпочтительно от 0,2 до0,8 мкм, Если диаметр частиц носите 35ля слишком велик,то пределы анализасужаются или становятся более нестабильными. С другой стороны, частицыносителя с малым диаметром приводят кэкономическим потерям при полученииреагента и имеют низкую чувствительность, Следовательно, частицы как счрезмерно большим, так и с чрезмерно .малыми", диаметрами испольэовать не следует.45Антигены, наносимые на частицы носителя реагента по данному изобретению включают в себя, например, белки, полипептиды, стероиды, полисахариды, липиды, пыльцу, пыль, гаптены и т.п.50 Антитела включают в себя, например, белки, получаемые реакцией с указанными антигенами.Концентрация частиц носителя обычно равна 0,03-0,3%, предпочтительно 0,05-0,27 (конечная концентрация).55 При более высокой концентрации частиц носителя необходимо использовать более сложное. оборудование для проведения анализа с реагентом по данномуизобретению, причем дальнейшее увеличение эффективности не достигается,При низких концентрациях частиц неполучают удовлетворительную чувствительность и реакционную способность.Частицы носителя можно сенсибилизи"ровать антигеном или антителом по любой известной методике, т.е. физической адсорбцией антигена или антителана частицах носителя, химическим связующим антигена или антитела с частицами носителя либо комбинацией этихспособов,Количество антигена или антителадля сенсибилизации носителя выбираютв зависимости от конкретного типа антигена или антитела и нужной точностианализа с помощью данного реагента,Частицы носителя, сенсибилизированные антигеном или антителом, передсуспендированием в водной среде могутбыть обработаны стабилизатором,включающим в себя аминокислоты, полипептиды, белки и т.п., которые не осаждаются в данной иммунологической реакции, причем в качестве стабилизаторапредпочтительно испольэовать сывороточный альбумин. Обработку стабилизатором предпочтительно проводить известным способом, с точки зрения храненияи стабильности реакции. Особенно значительный эффект достигается в техслучаях, когда антиген или антителофизически адсорбированы на носителе.Водная среда, в которой суспендирован носитель, сенсибилизированный ан"тигеном или антителом, должна иметь электропроводность, равную 5,0 или 2,5 мс/см, предпочтительно 1,0 мс/см и ниже. При электропроводности, превышающей 5,0 мс/см, реагент нестабильный, что приводит к снижению точности анализа.Водная среда может представлять собой воду, буферный раствор и т,п, и содержать одну или более добавку, выбранную из стабилизаторов, консервантов, хелатных агентов, поверхностно" активных соединений и т.д. Буферные растворы включают в себя глициновые буферы, буферы на основе фосфорной кислоты, цитратные буферы, барбиталовые буферы, боратные буферы, буферы на основе системы трис(трис)гидроксиметил(аминометан)-соляная кислота, трис-малатные буферы, аммонийные буферы и т.п.Стабилизаторы включают в себя, например, указанные стабилизаторы в концентрациях 0,001-17, предпочтительно 0,05-0,67.Предлагаемые консерванты включают5 в себя мертиолат и азид натрия,В качестве хелатных агентов используют этилен-диаминтетрауксусную кислоту, нитрилтриуксусную кислоту, циклогександиаминтетрауксусную кислоту ит,п в качестве поверхностно-активных соединений - неионогенные поверхностно-активные соединения,рН водной среды равен 5-10 или 1 ч6-9,5, предпочтительно 6,5-8,5, ЕслирН водной среды меньше чем 5, то реагент нестабильный, хотя чувствительность повышается, Водная среда, имеющая значение рН,более 10, приводит кснижению чувствительности и в некоторых случаях к нестабильности хранения реагента,Частицы носителя, сенсибилизирован.ные антигеном или антителом, суспендируют в водной среде в концентрации0,01-203, предпочтительно 0,05-10 Х,При более низкой или более высокойконцентрациях результирующий реагентьимеет, пониженную стабильность, егоиспользование становится неудобным иограниченным,Предлагаемый реагент получают сенсибилизацией описанных частиц носителя антигеном и антителом известнымспособом с последующей обработкой сенсибилизированного носителя стабилизатором и суспендированием носителя вводной среде известным способом,Реагент по данному изобретению при"40годен в качестве реагента или основного раствора реагента для проведенияреакции на стеклянной пластинке илив испытательной пробирке с визуальнымнаблюдением за агглютинацией или припроведении реакции в оптической кювете с оптическим контролем за ходомреакции,Реагент может быть использован дляанализа иммунологической реакции. Для Б 0этого предлагаемый реагент разбавляют буферным раствором и доводят концентрацию носителя, сенсибилизированного антигеном или антителом, доуровня, пригодного для анализа иммунологической реакции.Концентрация реагента зависит отвида анализируемого антитела или антлгена, их концентрации и реакционной способности, что определяется экспериментально. В случае оптическогоизменения иммунологической реакцииконечная концентрация носителя равнане менее 0,03 вес. . или от 0,05 до1 вес,7. и более, предпочтительно0,1-0,5 вес.В случае визуального наблюденияиммунологической реакции результирующая концентрация лежит в интервалеот 0,05 до 0,8 вес. , предпочтительно от 0,1 до 0,5 вес.Е.Буферные растворы, которые можноиспользовать для разбавления реагента, включают в себя глициновые буферы, боратные буферы, буферы трисхлористоводородная кислота, трпс-малатные буферы, аммонийные буферыи т.п.рН используемых буферных растворов 7,6-9,6, предпочтительно.8,0-9;О,Буферный раствор с более низкими зна"чениями рН вызывает агглютинацию и,следовательно, делает реагент непригодным, хотя и приводит к повышениючувствительности, При более высокихзначениях рН снижается чувствительность и могут нарушаться свойства прпхранении при повышенных температурах,что нежелательно,Таким образом, при визуальном наблюдении иммунологической реакции заданное количество реагентов и образца, содержащего антиген или антитело,смешивают на стеклянной пластинке илив испытательной пробирке и наблюдаютагглютинацию сенсибилизированных частиц.В случае оптического измерения иммунологической реакции заданное количество реагента и образца, содержащего антиген или антитело, смешивают иопределяют в оптической кювете изменение светопропускания, светорассеянияили помутнения,Если оптическое измерение проводятопределением светопропускания, тообычно используют свет с длиной волны, большей чем средний диаметр частиц носителя, с соотношением длиныволны к диаметру частиц, равным не менее 1,1 или не менее 1,5 и предпочтительно не менее 2. Длина волны обычнолежит в интервале от 600 до 2400 нм,предпочтительно от 800 до 1800 нм,Если свет имеет меньшую длину волны,то для получения подходящего светопропускания необходимо использовать час 143 бб 2тицы носителя в достаточно низкой концентрации, а также реагент, имеющий крайне высокую диспергируемостьр что приводит к трудности увеличения чувствительности и в некоторых случаях к обратимому протеканию реакции. Большая длина волны также нежелательна из-за снижения чувствительности, Свет может быть как монохроматическим, так 10 и полихроматическим, Оптическая кювета, используемая для измерения свето- . пропускания имеет толщину от 0,2 до 10 мм.Измерение пропускания можно прово-;5 дить определением времени, требуемого для достижения заданного значения поглощения, либо определением повышения поглощения за определенный промежуток времени,Оптическое измерение с использованием светорассеяния проводят, как приопределении светопропускания,Предлагаемые реагенты представляют 25собой сепсибилизированные частицы реагента для использования в иммунологических реакциях, С их помощью можно определять количества антигена илиантитела в различных образцах с хорошей воспроизводимостью и высокой точностью, Кроме того, они эффективныпосле замораживания и размораживанияи, следовательнор могут быть лиофилиэованы и использованы повторно,Способ иллюстрируется следующимипримерамиП р и м е р ,Глобулиновое антитело.против Ы -Фетопротеина растворяют в 0,1 Г 1 глициновом буФере (рН 8,8). Чис-.,10 ло глобулиновых антител соответствует 800-1500 на каждую латексную частицу (имеющую диаметр О, 052 мкм, производство Фирмы Пои СНеш 3.са 1). Затем раствор смешивают с равным объемом латексглицинового буфера (рН 8,8 при перемешивании и комнатной температуре для достижения адекватной сенсибилизации), После разделения центрифугированием супернатант удаляют и осадок обрабатывают соответствующим количеством бычьего сывороточного альбумина, Получен, ные таким образом сенсибилизированные частицы суспендируют в буферном раст" воре с концентрацией частиц 1,0%, имеющем электропроводность 1,5 мс/см и содержашем соответствующее количество консерванта, после чего суспензию оставляют на хранение, С результирующимреагентом достигается отличная точность анализа,Для анализа иммунологической реак" ции реагент разбавляют глициновым буфером (рН 8,6).Результаты анализа представлены в таблице. Образец сыворотки, нг/мл Опыт 3(45,0) 906, 2 917,5 887,5 901 р 3 906,3 937,1 885,0 918,0 913,5 925,3 921 рО 887,2 Среднеезначение 41,9 187,7 908,8 Стандартное отклонение 2,26 16,4 4,49 Коэффициент вариации 5,4% 1 р 8% 2,4% П р и м е ч а н и е. Значения в скобках йолучены радиоиммунным анализом,П р и м е р 2, Антитело анти-СРБ (С-реакционноспособного белка) рас творяют в 0,2 Г 1 боратном буфере (рН 8,8) и латексные частицы (диаметр 0,220 мкм, производство Эоы СЬешса 1) суспендированные в таком же буфере, сенсибилизируют результирующим раствором таким образом, чтобы каждая частица несла на себе 800-1800 анти 1 45,2 2 41,3 3 42,044,5 5 44,6 6, 43,б 7 42,5 8 42,0 9 38,9 10 38,6 11 40,2 12 39,7 189,2 190,5 195,8 181,1 190,5 189,7 180,1 184,5 180,5 184,2 185,6 190,1генов, Сенсибилиэированные латексныечастицы обрабатывают бычьим сывороточным альбумином и суспендируют в соответствующем количестве боратного буфера (4,0 мс/см) с концентрацией час 5тиц 2,0 , Результирующий реагент обладает очень высокой точностью измерения.П р и м е р 3. Антитело Р (аЬ) 10крысы или козы против человеческогофибриногена растворяют в 0,1 М трисмалатном буфере (рН 8,6), а латексные частицы (диаметром 1,091 мкм, производство Пою СЬешса 1), суспендированные в таком же буфере, сенсибнлизируют результирующим раствором, чтобы чувствительность результирующегореагента была равна величине порядка100 нг/мл, Затем частицы обрабатывают 20бычьим сывороточным альбумином и суспендируют в водном растворе, содержащем 0,1 азида натрия (1,0 мс/см) приконцентрации частиц 0,01 Х. При исполь.зовании реагент разбавляют тряс-малатным буфером (рН 8,4) или буферомтрис"хлористоводородная кислота (рН8,4) до нужной концентрации латексаи проводят реакцию на стеклянной пластинке либо реагент может использовать ся без разбавления для оптическогоанализа, При реакции на стекляннойпластинке с использованием этого реагента различают агглютинирующую инеагглютинирующую системы, 35П р и м е р 4, Глобулиновое антитело козы против человеческого растворяют в 0,1 М трис-малатном буфере(рН 8,8) н раствором сенсибилизируютлатексные частицы (диаметром 0,312 мкм,40производство Поч СЬеппса 1), суспендированные в таком же буфере. Сенсибилиэированные частицы обрабатываютзатем бычьим сывороточным альбуминоми в конце суспендируют в водном растворе с концентрацией частиц 2 Х, имею"щем проводимость, равную приблизительно 3,0 мс/см, При использованиисуспензию разбавляют 0,1 М трис-малатным или трис-НС 1 буфером до требуемой 50концентрации нли используют сам посебе,П р и м е р 5. Крысиное антителоР (аЪ) против человеческого 18 Арастворяют в 0,2 М боратном буфере(рН 8,3), раствор обрабатывают также,как в примере 4, и получают целевойреагент в суспензии с концентрацией1 за исключением того, что водный раствор, используемый для конечногосуспендирования сенсибилиэированныхчастиц, имеет проводимость, равнуюприблизительно 0,5-0,8 мс/см.П р и м е р 6, Латексные частицысенснбилизируют высокоочищенным крысиным антителом против человеческого1 ИМ в глициновом буфере с рН 9,6.Количественные соотношения изменяютв зависимости от качества антител нот нужной чувствительности, Сенснбилизированные частицы обрабатывают состветстветствующим количеством бычьегосывороточного альбумнна, а затем сус"пендируют в водном растворе, имеющемпроводимость, равную приблизительно1,2 мс/см, который может содержатьприблизительно 0,05 бычьего сывороточного альбумина, в результате чегополучают целевой реагент с концентра"цией частиц 2,5 Х.П р и м е р 7. Высокоочищенное крысиное антитело Р (аЬ ) против ЬССрастворяют в 0,2 М трнс-НС 1 буфере(рН 8,6) и результирующий раствор используют для сенсибилиэации в нем латексных частиц (днаметром 0,220 мкм,производство Пою СЬепаса 1), суспендированных в таком же буфере, при ком"натной температуре. После обработкисоответствующим количеством бычьегосывороточного альбумина сенсибилизн"рованные частицы суспендируют в водном растворе, имеющем проводимость,равную приблизительно 0,8 мс/см, нконцентрацию частиц 1 Х, и затем остав-ляют на хранение,П р и м е р 8, Латексный реагентполучают в условиях примера 7, заисключением того, что используют античеловеческое 8-антитело 2(аЪ )1 илатексные частицы, имеющие диаметр0,089 мкм (производство Ром СЬепаса 1),Концентрация латекса равна 0,25 Х, Результирующий реагент показывает хорошую точность анализа,П р и м е р 9. Латексный реагентполучают в условиях примера 7 эа нск"лючением того, что используют анти"сеа (канцероэнбиотический антиген) антитело Г (аЬ ) и латексные частицы,имеющие диаметр 0,8 мкм (производствоРою СЬешхса 1), Концентрация латексаравна 1 Х. Результирующий реагент пока-.зывает хорошую точность анализа,П р и м е р 10, Латексный реагентдля анализа 1-фетопротеина получаютпо методике, описанной в примере 3,1;31662 тител, приближаясь по чувствительности к радиоиммунному анализу. Составитель Г,Крюкова Техред Л. Олийнык Корректор О.Кравцова Редактор И,Иедолуженко Заказ 5356/.58 Тираж 6.55 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д, ч/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 за исключением того что электропро-,водность доводят до 5 мОм"/см, Результирующий реагент показывает хорошуюточность анализа,5П р и м е р 11, Повторяют методику примера 1 с использованием частицлатекса размером 1,20 мкм, Реагент показывает высокую точность измерений,П р и м е р 1 2. Повторяют методику 10использованную в примере 2, с использованием буферной среды, электропроводность которой составляла 2,5 мОм //см , Реагент показывает высокую точность измерений, 15Таким образом, предлагаемый реагент обладает высокой чувствительностью при обнаружении антигенов и анФ о р м у л а и з о б р е т е н и яСпособ получения реагента для проведения реакции агглютинации, включающий сенсибилизацию частиц носителя антигеном или антителом и суспендирование в водной среде, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности реагента, для сенсибилиэации используют частицы носителя размером О, 052-1, 2 мкм и суспендирование осуществляют в среде с электропроводностью 5,0 мс/см и меньше и с концентрацией частиц 0,01- 20 .