Способ получения иммобилизованной монофенол-монооксигеназы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 12 10 ГОСУДАРСТВЕННЫПО 4 ЕЛАМ ИЗОБРЕ ОМИТЕТ АЗССРНИЙ ИОТНРЫТИЙ ЗОБРЕТЕНИ ОПИ ВИДЕТЕЛЬСТ АВТОРСНО ич,ева,рудового екстильи соррег1 цЬ 1 е1 ЬепвасС. ЮЩ ВЮй(71) Ленинградский ордена ТКрасного Знамени институт тной и легкой промышленностиим. С.М. Кирова и Вотаническститут им. В,Л. Комарова(56 ) 1. Патент СИА Р 3897308кл. С 07 С 7/02, 19752. ВСепе,1, Ч ТомпвЬепйРеФегапаФоп оГ Сгасев оГЬу асФча 1 оп оГ аФегпвоароро 1 урЬепо 1 охйаве. 1. оСЬеш 1 са 1 Яосе 1 у Ра 1 Соп Тга1973, ч.5, р.р. 495-501 ЛО 10701 А(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗО ВАННОЙ МОНОФЕНОЛ-МОНООКСИГЕНАЗЦ путем обработки органического носителя раствором, содержащим монофенол-монооксигеназу, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью сохранения активности фермента при иммобилизации и упрощения процесса, в качестве носителя используют аминосодержащее полиакрилонитрильное волокно с обмен ной емкостью 2-3 ммоль/г, а в качест . ве раствора, содержащего фермент, ис пользуют культуральный фильтрат базидиального гриба сог 1 о 3 пв ьгвпсцв, 1070164Изобретение относится к получению иммобилизованных Ферментов, в частности полифенолмонофенои-монооксигеназы (полифенолоксидазы), которая мо" жет быть использована как катализатор со специфической и контролируемой 5 активностью в химической промышленности и в производстве дубильных веществ, а также в прикладной биохимии и микробиологии.Известен способ иммобилизации про мааленной грибной монофенол-моноокси.Ф.ганазы в жидких мембранах ( 13Недостатками способаявляются слож,ность получения жидких мембран , их нестабильность , а также невозможность 1 5 многократного йсполь зования иммобилизован ного эакапоулированного Фермента в. технологическом цикле и э -з а малой механиче ской устойчивости эмульсий иммобили зов анных Ферментов . 20Наиболее близким по технической сущности и.достигаемому результату к предлагаемому является способ получения имаобилизованной монофенолмоиооксигенаэы путем обработки органи 25 ческого носителя (энзакрил АА) раствором, содержащим монофенол-монооксигеназу. Способ заключается в ковалентной иммобилизации фермента на органическом носителе (энэакриле АА) с помощью реакции азосочетания 121.Недостатками известного способа являются низкая удельная активность целевого продукта (25% от активности растворимого) и длительность иммоби- З 5 лизации (65 ч).Цель изобретения -сохраненне активности фермента при иммобилизации и упрощения. процесса.Поставленная цель достигается 40 тем, что согласно способу получения иммобилизованной монофенол-монооксигеназы путем обработки органическогоносителя раствором, содержащим монофенол-монооксигенаэу,. в качестве 45 носителя,используют аминосодержащее полиакрилонитрильное волокно с обменной емкостью 2-3 ммоль/г, а в качестве раствора, содержащего фермент, используют культуральный фильтрат баэидиального гриба Сого 1 ця Ь 1 гяцсця.Предлагаемый способ позволяет ис, польэовать полифенолоксидазы, продуцируемые базидиальным грибом Сог- о 1 цв ЬгяцСця, т.е. вести иммобилиза цию из неочищенных культуральных фильтратов, что обеспечивает возможность исключить стадии осаждения, фильтрации и очистки фермента и таким образом испольэовать для иммобиЛизации более дешевый и доступный продукт.Иммобилиэованная на волокнистом носителе полифенолоксилаза является биологически активным гетерогенным катализатором, что, во-первых, поз воляет использовать иммобилиэованную полифенолоксидазу многократно, так как легко осуществить отделение волокна от растворимых продуктов реакции и субстрата, а во-вторых, обеспечивает воэможность перевода периодических технологических процессов на непрерывный режим.КРоме того, способ иммобилизации отличается простотой и высоким качеством получаемого продукта (выход по активности достигает 85-96%),Способ осуществляют следующим образом.Фермент полифенолоксидазу получают выращиванием баэидиального гриба Сог 1 о 1 хя п 1 гяцсця. поверхностным способом на питательной среде, содержащей, г: глюкоза 10, пептон 3, кн, го 0,6, кнго 0,4, м 8 Яо Тн о 0,5 и СцЯО 50 мг, УеЯО ТНО 5 мг и 2 л водойроводной воды. Продолжительность выращивания гриба составляет 10 сут при 24-26 С, Данный штамм синтезирует внеклеточную полифенолоксидазу, активность которой составялет 1,48-5,23 ед/мг белка, Активность определяют по окислению пирокатехина и парафенилендиамина,Для иммобилизации навеску аминосодержащего полйакрилонитрильного волокна обрабатывают в течение 30-60 мин культуральным фильтратом, полученным в результате выращивания гри 5 а Сог 1 о 11 я Ь 1 гвцСцв . По оконча.нии обработки продукт промывают дис-. тиллированной водой. П р и м е р 1. Аминосодержащее полиакрилоннтрильное волокно.(0,5 г) обменной емкостью 2 ммоль/г обрабатывают в течение 30 мин при 18 С 50 мл культурального фильтрата баэидиального гриба Сог 1 о 11 в ЬгяцСцв с активностью 1,48 ед/мг белка. Продукт отмывают дистиллированной водой. Получают препарат с активностью 4,17 ед/г волокна (90 от исходной),П р и м е р 2, Аминосодержащее полиайрилонитрильное волокно 0,5 г емкостью 2,5 ммоль/г обрабатывают в течение 45 мин при 20 С 50 мл культурального фильтрата баэидиального гриба Согхо 1 цв ЬгвцСця с активностью 4,13 ед/мг белка. Продукт отмывают дистиллированной водой. Получают пре- . парат с активностью 25,9 ед/г волокна (85 от исходной).П р и м е р 3. Аминосодержащее полиакрилонитрильное волокно 0,5 г с емкостью 3 ммоль/г обрабатывают в течение 60 мин при 22 С 50 мл культурального фильтрата базидиального гриба Сог 1 о 1 цв Ьгвцсця с активностью.5,23 ед/мг белка. Продукт отмывают дистиллированной водой. Получают препарат с активностью 40 ед/гволокна (80 от исходной).Заказ 11643/27 Тираж 522 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 При иммобилизации Фермента проис-,ходит образование стабильного комплекса ферме .т-волокно, что подтверждается устойчивостью связи междуносителем и Ферментом, которая неразрывается в ацетатном и Фосфатномбуфере с различной ионной силой ирН. Наиболее вероятно, что связьбелка с носителем осуществляется вданном случае по механизму координационно-ионной иммобилизации с образованием комплекса металлосодержащийФермент - аминосодержащая хелатообразующая группировка волокнистого носителя,Стабильность комплекса фермент - 15волокно оценивается в конкретныхтехнологических процессах, в частности при окислении о-дефенолов,Полученные образцы иммобилизованного фермента на аминосодержащем волокне имеют высокую стабильность,позволяющую использовать их многократно. За 7 циклов использования актив ность снижается только на 30. Иммобилиэованный фермент обладает более высокой термостабильностью, чем растворимый. Определение активности проводят ,по методу, основанному на измерении активности Фермента по скорости образования сине-фиолетовой окраски окисленного диметил-и-Фенилендиамина в присутствии пирокатехина. Активность А вычисляют по найденной ско-. рости реакции по формулеЕ(а б Ъ)с С. где Еэкстинкция (0,200),а - отношение количества жидкости, взятой для приготовлениявытяжки,степень дополнительного разведения вытяжки,5 - степень постоянного. разведения вытяжки в реакционнойсмеси;с - толщина слоя (2 см);время (в секундах). При иммобилизации монофепил-монооксигенаэы в условиях, параметры ко" торых находятся ниже укаэанных пределов, не достигается удовлетворительньщ результатов по активностиимиобилизованной на волокне полифенолоксидазы, Превышение этих условий не обеспечивает роста активности фермента на волокне и является неэкономичным. Использование в качестве носителя аминосодержащего полиакрилонитрильного волокна емкостью менее 2 ммоль/г не обеспечиваетполного извлечения Фермента из культуральнаго фильтрата, а применениеволокна емкостью выше 3 ммоль/г .не"целесообразно, поскольку при этомне наблюдается роста активности иммобилизованного фермента.Иммобилизация фермента на волокнистом носителе непосредственно изкультурального фильтрата,базидиальных грибов экономически нецелесообразна, во-первых, из-за исключениятаких стадий выделения и очисткифермента, как осаждение и фильтрация.Во-вторых, стоимость культуральногофильтрата невелика по сравнению счистым ферментом и составляет около30 руб/т. Иммобилизация непосредственно иэ культурального фильтратапозволяет снизить расход на получение фермента в 200 раэ. Активностьиммобилизованной на волокне полифенолоксидаэы составляет 80-90 от Исходной, что на 55-65 выше по сравнению с известным способом. Эти свойства позволяют рекомендовать фермент- содержащие волокна в качестве биокатализатора, волокнистая форма которого облегчает возможность проведения ферментативных реакций по непрерывной схеме,