Способ получения иммобилизованного трипсина

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 09) (11 1) С 12 Н 9/761 С 12 М 11/06 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯАВТОРСН ЬСТВУ 2. Способ по и. 1, ощ и й с я тем, что иоптицы геля на основе водсодержащей, мас.В:Сывороточный альбумкГлицеринГлутаровнй альдегкд тлкч ольэуют ч ной смеси н 4-5 2-3 2-3ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(56) 1. Березин И.В. и др. Иммобклк;вованные ферменты. М., ивд. МГУ,1976 т,1 с, 1652. БогачеваТ.И.,Миргородская О.А., Москвичев Б.В. Некоторые особенности взаимодействия трипсина с глутаровым алъдегидом в растворе." -ффПрикладназ биохимия и микробзологияф, 1976 т. Х 11, вып. 3, с. 428431.3. ффукраинский биохимический зурнал.ф, 1955, з 1, с. 94-100. (54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИИИОБИЛИЗОМННОГО ТрИПСИНЛ, предусматривающий связывание трипскна с сывороточным альбумином с помощью глутаро-; вого альдегкда, о т л и ч а ю щ н йс я тем, что, с целью повыяення устойчивости получаемого продукта к тканевым ингибиторам.н ингнбиторам крови, сывороточный альбумин используют в форме частиц геля н процесс ведут при 4-10 С путем обработки гелевых частиц глутаровым алъдегидом с последующим связыванием с ферментом прн следующем соотношении компонентов в реакционной смеси, масЛГель алъбумина 15-20 Глутаровый альдегкд 1-2 Трипсин 3-560 4,52,32,3До 100 Изобретение относится к медицинской энзимологии, а конкретнее к протеолитическим ферментам медицинскогоназиачения, и может быть использовано при лечении гнойно-воспалительныхпроцессов например в отоларинголо-.гии, стоматологии, при лечении ожогов, гнойных ран и т,д,Известны способы иммобилизации истабилизации протеаз, в частноститрипсина, включающие их связываниес различными носителями, что позволяет повысить их устойчивость к действию теМпературы, рН, денатирующихагентов, к действию Ферментов микроорганизмов, ингибиторов, к автолизуи т.д. 1) .Медицинское применение иммобилизованных Ферментов выдвигает специфические требования к свойствамматериалов, используемых в качественосителей ферментов, в частностиотсутствие канцерогенных и токсических свойств, слабая антигенность,устойчивость к действию ряда ферментов и др. Этим требованиям биосовместимости в наибольшей степени отвечают носители белковой природы,например сывороточный альбумин,Известен способ получения иммобилизованного трипсина с использованием сывороточного альбумина человека, который заключается в связывании фермента с молекулами альбуминав растворенном состоянии, причемфермент предварительно обрабатываютглутаровым альдегидом. Процесс ведутпри 22 С при следующих концентрацияхкомпонентов в реакционн 6 й смеси,мг/мл: трипсин 0,5; глутаровый альдегид 0,25-0,4; сывороточный альбумин10, .При этом получают растворимыеассоциаты трипсина с сывороточнымальбумином с молекулярной массой до1106 )2 .Однако продукт, получаемый этимспособом, проявляет недостаточнуюустойчивость к тканевым ингибиторами ингибиторам крови (13-53 - приконцентрации сыворотки крови 0,1 млна 1 мл реакционной смеси).Целью изобретения является повышение устойчивости иммобилизованного трипсина к тканевым ингибиторами ингибиторам крови.Указанная цель достигается предлагаемым способом получения иммобилизованного трипсина, предусматривающим связывание Фермента с сывороточным альбумином с помощью глутарового альдегида, причем сывороточный альбумин используют в форме час"тиц геля, а процесс ведут при 4-10 СОпутем обработки гелевых частиц глу,таровым альдегидом с последующимсвязыванием с ферментом при следующем соотношении компонецтов в реакционной смеси, мас.: гель альбумика 15-20; глутаровый альдегид 1-2;трипсин 3-5,Обычно используют частицы геляна основе водной смеси, содержащей,мас,: сывороточный альбумин 4-5;глицерин 2-3; глутаровый альдегид2-3.В результате трипсин связываетсяс твердыми частицами альбуминовогогеля. Получают не растворимое в воде10 производное трипсина,Конформационная стабильность молекул трипсина, Фиксированных путеммноготочечного закрепления на сетчатой структуре альбуминового геля,15 оказывается выше, чем в растворимыхассоциатах с лабильной конформациейпо.известному способу. Кроме того,при многоточечной Фиксации на сетчатой структуре геля эффективно блокируются центры молекул трипсина, ответственные эа взаимодействие с ингибиторами,В результате остаточная активность иммобилизованного трипсина пос-25 ле действиясоевого ингибитора вконцентрации 0;1 мг/мл составляет60, а после действия сыворотки крови в концентрации 0,4 мл на 1 млсмеси - 97,Используемые по Предлагаемомуспособу в качестве носителя частицыгеля сывороточного альбумина получают путем нагревания .на кипящей во"дяной бане в течение 15-20 мин водной смеси, содержащей, мас.: сывороточный альбумин человека 4-5;глицерин 2-3 глутаровый альдегид2-3; вода - до 100, с последующимизмельчением Указанный интервалвремени нагрева достаточен для пере-40 вода раствора альбумина в гель приминимальных затратах тепловой энергии. 1 акое соотношение ингредиентовподобрано, исходя из требований получения механически прочного геля45 при минимальном расходе сывороточного альбумина.Соотношение ингредиентов при иммобилизации установлено экспериментально из зависимостей активностиЩ нерастворимой Формы трипсина от со,отношения Фермент - носитель.Указанные ингредиенты вводятсяв последовательности: вода, гельсывороточного альбумина человека,глутаровый альдегид, трипсин. П р и м е р. Гель сывороточного альбумина человека получают путемнагревания на кипящей водяной банев течение 15 мин смеси, содержащей,мас.:Сывороточный альбуминчеловекаГлутаровый альдегидГлицеринВода1055771 Ингибитор Концентрация Остаточная активность фермента,ингибитора, В от исходноймг/мл Иммобилиэованный Растворимыйфермент Фермент Ингибитор трипсина из бобов сои 0,1 60 50 0 КонтриКал Пантрипин 50 70 а Овомукоид 97 0,4 мг на1 мл смеси Сыворотка крови Составитель О, СкородумоваРедактор Н, Егорова Техред Л.Бабинец . Корректор А . Зимокосов Тираж 523 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР поделам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Рауюская наб., д. 4/5Заказ 9241/22 Филиал ППП фПатентф, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 На практике, например для внутри- полостного введения больному, Ферментный препарат часто удобно использовать в виде; водной суспензии. Поэтому образовавшийся гель после охлаждения продавливают через сито с диаметром пор 250 мкм, а затем отсеивают частицы с размерами менее 50 мкм, используя сито с соответствующим диаметром пор. В результате получают фракцию частиц геля с размерами пор 50 - 250 мкм, которую многократно. промывают дистиллированной водой.Иммобилиэацию трипсина на частицах геля сывороточного альбумина проводят в водной среде при соотношении ингредиентов, мас.ЪТрипсин 3,8Гель сывороточногоальбумина человека 18,9Глутаровый альдегид 1,9ВодаДо 100Указанную смесь инкубируют при 4 С на протяжении 1 ч. После инкубацйи гель с иммобилиэованным трипсином многократно промывают дйстиллированной водой, контролируя наличие белКа в растворе по поглощению при длине волны 280 нм в промывных водах. Активность иммобилизованного и растворимого трипсина измеряют по .Кунитцу вмодификации М.П, Черникова 3, при этом в качестве субстрата используют казеинВлияние инги-биторов на казеинолитическую активность,трипсина исследуют в опытах,в которых Ферментный препарат иингибитор инкубируют в течение15 мин при 20 С, При этом сравниваютпоказатели для водорастворимоготрипсина и иьмобилиэованного препарата в виде водной суспензии.Полученные результаты представле ны в таблице, из которой становитсяочевидным, что иммобилиэованный начастицах геля сывороточного альбумина человека трипсин значительно усойчивее к действию ингибиторов тка ней и крови,чем растворимый. Использование изобретения позво-. лит получать препараты трипсина с повышеннЬй устойчивостью к тканевым ингибиторам и ингибиторам крови, что даст воэможность достигнуть эффекта пролонгирования действия препарата при его применении в терапиигнойно-воспалительных процессов и эа счет уменьщения числа повторных введений препарата больным уменыаить степень травмирования тканей больного, снизить затраты на лекарственные :препараты при лечении (экономйя фермента, обезболивающих и .антйсептических средств и т.д.), а также снизить затраты труда и времени обслуживающего персонала.