Способ получения препарата бактериальной люциферазы

69 ИИ ЗСЮ С 2 ЕТ 2. Спо ю щ н й с разы при линейным буфера рН центраций личию люциществляосфатно оп. 1, оем, что элютографии осентом К/Юа7,0 в предв1 М. ом ах конГОСУДАРСТВЕННЫЙ ИОМИТЕТ СССР 0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И 0(ИРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(72) В.В.Межевикин, Е.С.Высоцкий, В.В.Заворуев и З.К.Родичева (71) Институт биоФизики Сибирского отделения АН СССР(5 б) 1. Т.Ьее, С 1. МцгрЬу, О,Ь.Га 1 пХ, Т.Ь,Вапсощ. Васех 1 а 1 Ыо 1 цщ 1 певсепсе апй 11 в арр 11 саМ 1 оп 1 о апа 1 у 11- . са 1 ргоседцгев. Хп "Ь 1 ццЫ зс 1 пЫ 1 " 1 1 аЫоп соцпй 1 пд", Нею-уогК, Асадещ 1 с Ргевз 1 пс 1974, р,403-420,2. Авторское свидетельство СССР Р 785318, кл. С 12 й 9/02, 1979.3. Воробьева Т,И., Высоцкий Е,С., Эаворуев В.В., Межевикин В.В. Регуляция синтеза люциферазы у РЬосоЬас 1 ег 1 щп юапйаравепз 1 в.-фМикробиология", 1980, т. 49, Р 4, с.517-520,4. Фиш А.М. Исследование некоторых сторон метаболизма светящихся . бактерий в непрерывной культуре. Автореф. канд. дис., Красноярск, 19 б 9.5, Гинсберг Г, -В кн. Методы вирусологии и молекулярной биологии, М., фМир", 1972, с.322. ЕСТ;.йЪД. яИЙ":.";."с( 54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРА ТА,БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЛЮЦИФЕРАЗЫ включающий выращивание культур бактерий рода Рпо 1 оЬасСег 1 цщ на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, кислорода и мине.ральные соли, в аэробных условиях, отделение клеток, их разрушение, отделение клеточных оболочек и колоночную хроматографию ферментсодержащего раствора, о т л и ч а ю щ и йся тем, что, с целью упрощения про" цесса, в качестве наполнителя для колонок используют СаНРО НО, полученный после хроматографии элюат концентрируют и хроматографируют повторно.соб и т а 1035062Изобретение относится к медицинс- кой, микробиологической и ферментной промышленности и может быть1применено в биохимии, медицине, микробиологии и аналитической химии .для определения содержания ряда метаболитов, таких, например, какфлавинмононуклеотид, пиридиннуклеотиды, альдегиды, и т,д., а также для определения активности ферментов, связанных с метаболизмом этих ве,ществ.Известен способ получения препарата бактериальной люциферазы, включающий вырАщивание культуры РЬогоЬас Еег 1 цтп Г 1 зсЬег 1 на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, кислород и минеральные соли, в аэробных условиях в течение 24 ч с последующим отделением клеток, разрушением их, отделением клеточных оболочек, фракционированным осаждением белков высаливанием сульфатом аммония при насыщении 30- 75, отделением осадка фермента, растворением его. в буфере и очисткой его путем колоночной хроматографии в присутствии буфера на сефадексе Си диэтиламиноэтилцеллюлозеДЕАЕ) и диэтиламиноэтилсефадексеА1.Недостатком этого способа является низкая удельная активность получаемого препарата люциферазы (для ГМИН- 9 10" квант, с-" мк-" .Наиболее близким к предлагаемому является способ получения препарата бактериальной люциферазы, включающий выращивание культуры светящихся бактерий РЬоСоЬасйег 1 цп Й 1 зсЬег 1 на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, узота, кислорода и минеральные соли, в аэробных условиях, отделение клеток и их разрушение обычно в результате обработки детергентом Тритон Хв количестве 0,5-1,0 Ъ от веса клеток и действия ультразвука), отделение клеточных оболочек, фракционированное осаждение люциферазы сульфатом аммония при насыщении 78-80, отделение осадка люциферазы, растворение его в буфере, диализ на сефадексе 6-75, колоночную хроматографию на сефадексе 6-75 и триэтиламиноэтилцеллюлозе. Хроматографию осуществляют в К/Ба-Фосфатном буферерН 7,0 0,02 М.). Люциферазу с колонки, наполненной триэтиламиноэтилцеллюлоэой, элюируют линейным градиентом ИаС 1 в интервале концентРаций 0-0,5 М в К/Ва-фосфатном буфере, Полученный элюат пропускают через колонку с сефадексом 0-25 для удаления солей и перевода Фермента в летучий буфер - триэтиламин-НС 10,01 М, рН 8,8), а затем лиофилизи руют. Процесс выращивания ведут,обычно в течение 9-11 ч на средеследующего состава, вес%: КаНРО0,7-1,0; КНРО, 0,1-0,2(ЯН) НРО0,05-0,07 МАМБО 0,01-0,02 пептон1,0-1,5 ЮаС 1 28-33, остальнре5 дистиллированная вода.Активность полученного препаратас РАН1, 75 10 квант с мг " 2 ) .Недостаткомиэтого способа являются относительная сложность спосо",10 "ба, связанная с тем, что получениепрепарата включает четыре колоноч-,ных стадии, причем в качестве наполнителей для колонок используют импортные материалы, что значительно5 удорожает получение люциферазыЦель, изобретения - упрощениеспособа.Указанная цель достигается тем,что согласно способу получения препарата бактериальной люциферазы,включающему выращивание культурысветящихся бактерий рода РЬоСоЬас 1 ег 1 цщ на жидкой питательной среде,содержащей источники, углерода,азота, кислорода и минеральные соли,в аэробных условиях, отделение клеток, их разрушение, отделение клеточньв оболочек и колоночную хроматографию ферментсодержащего раствора, в качестве наполнителя для ко 30 лонок используют СаНРО 4 НО ( брушит),полученный после хроматографии элюат концентрируют и хроматографируют повторно,Элюцию люциферазы при хроматогра 35 фии обычно осуществляют линейньмграднентом К/Ба фосфатного буферарН 6,6-7,0 в пределах концентраций0-0,1 М,40 45 50 55 60 65 Способ обеспечивает упрощение процесса выделения за счет использования легкодоступного наполнителя для колонок, который может быть легко приготовлен в обычных лабораторных условиях, при этом уровень активности получаемого препарата не уступает активности известного.Предлагаемый способ получения препарата люциферазы заключается в следующем: выращивают культуру светящихся бактерий, в частности, РЬо 1 оЬас 1 ег 1 щп 1 е 1 оцпа 1 Ь 1 на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, кислорода, и минеральные соли, в аэробных условиях, отделяют клетки, разрушают их известными методами, удаляют клеточные оболочки, полученный раствор хроматографируют на брушите, элюат, содержащий люциферазную активность, концентрируют и хроматографируют повторно на этом же адсорбенте, Активность препарата измеряют по известной методике ГЗ .Калибровку фотоумножителя ФЭУ-б 4 проводят известным способом Г 4 162 310350 Активность полученного препарата 1 с ГМИН не ниже 1,8-2,0 10квант.с"мгСоставитель О.СкородумоваРедактор А.Авраменко Техреду.Костик КорректорВ. Бутяга Эаказ 5759/23 Тираж 523 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва; Й, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 П р и м е р . Для получения препарата бактериальной люциферазы используют РЬойоЬасйег 3.ша 1 е 3 оцпаСМ 5. , штамм 262 нэ коллекции Института биофизики СО АН СССР. КультуруРЬоВоЬасгег 3.цв 1 е 3 оцпайЫ. предвари- тельно выращивают на качалке на сре.де следующего .состава в г/л: ЯаС 1 0 30,0, КНтРО 1,0; ЯаНРОл.,12 НО 6,0; (ИН) ,ЯРО 4 д,5 У Мд 804. 7 НО 0,2 у бактопептои 10,0, глиьерин 3,0; во- . да дистиллированная переносят стерилъно в ферментер 01 ггойегвр (ЬКВ, Швеция), чтобы исходная плотность эасева составляла около 2-3 10 клеток/мл и осуществляют ферментацию в течение 3,5 ч при 27 + 0,2 С. В.конце ферментации клеткй отделяют центрифугированием при 10000х х 10 мин, отмывают холодным 3-ным раствором ИаС 1 и хранят до использования в морозильной камере бытового холодильника. Для получения препарата люциферазы берут 10 г биомассы светящихся бактерий, заливают холодной дистиллированной водой в соотношении 5 мл воды на 1 г биомассы и разрушают их трехкратным замораживанием - оттаиванием, кле- ЗО точные обломки осаждают центрифуги. рованием 10000 х 25 мин, а супернатант, содержащий люциферазу, наносят на колонку с брушитом 2,5 х х 20 см). Колонку предварительно 35 уравновешивают дистиллированной водой. Брушит готовят по известной методике 5 . После нанесения супернатанта колонку промывают дистиллированной водой до полного выьывания белка, не сорбирующегося на брушите в данйых условиях. ЗЪоциферазу элюируют. линейным градиентом К/Иа фосфатного буферарН 6,8) в пределах концентраций 0-0,1 М, Градиент .создают с помощью смесителя 011 гоу.ай:(ЬКВ, Швеция). Скорость прокачивания буфера через колонку поддерживают с помощью перистальтического,насоса на уровне 50 мл/ч Послеэлюирования фракции, содержащие активность, собирают, и концентрируютс помощью аппарата для ультрафильт. рации ФМО 2-200 1 возможно концентрирование высаливанием сульфатом ам.мония) на мембране СМ 18 до 15 млхроматографируют повторно. Все операции выполняют при температуре неваде 40 С. При хроматографии полученного препарата на ультрагеле АСА наблюдается один симметричный пик,причем распределение белка и активности-совпадают. Молекулярный весэтого белка, определенный с помощьюнабора белков Фирмы "Яегча" около80000 дальтон, При электрофорезе вполиакриламидном геле в присутствиидодецилсульфата Иа наблюдается только две полосы с суммарным молекулярным весом также около 80000 дальтон, Чистота полученного препаратане менее 95. Активность препаратв данном примере 1,81. 10 квант,с мгпри измерении с ГМЙН 1 и миристиновымальдегидом.Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить препарат бактериальной люциферазы, по активности не уступающий препарату люциферазы, описанному в прототипе. Предлагаемый способ более прост и не требуетимпортных наполнителей для колонок,что удешевляет получение препарата.Помимо РпооЬасег 1 ца 1 е 1 оцпа 1 Ы.,способ пригоден для выделения люциФеразы из светящихся бактерийРпо 1 оЬас 1 ег 1 цв рпозрЬогеив и ВепееЕеа Ьагчед 1. Однако люцифераза изэтих видов характеризуется болеенизкой активностью,