Способ определения активности протеаз

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК За а 01 И 33 ОСУДАРС ПО ДЕЛАМ АВТОРСКОМ ИДЕТЕПЬСТ 21) 22) 46) 72) нсА.М (71 ког(56) Греб и ми ия 6282 льь.пд с. 2 ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ 3 31 1 598/28 -1 330.06.8107.07.83. Бюл. 9 25В,Н. Петушков, Г.Ь. КратасюФиш и И.И. ГительзонИнститут Физики им, Л.В. Ки616,07(088.8)1. Лукава Л.М Федорова Л.шкова Р.Н. Прикладная биохимробиология. Т. 9, вып, 4, с Иив О., Ва 0 оДжзп Т,О Наве;С.Х. Апайу Вхоспеш. 1974,0- 287.( 54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОТЕАЗ путем совместного инкубирования люциферазы о исследуемойпробой с последующим измерением биолюминесценции инкубационной среды,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью, ускорения и повышения точности способа, в инкубационную смесьпредварительно вносят восстановленный никотинамидадениндинуклеотид флавчнмононуклеотид оксидоредуктазу иее субстраты, а исследуемую пробудобавляют после установления стабиИзобретение относится к биохимиии может быть использовано н технической микробиологии и медицинскойдиагностике.Известен способ определения активости протеаз путем гидролиза белкаказеината натрия препаратом Фермента,который помещают в исследуемый раствор с последующей инактивацией фермента и осаждением непрогидролизонан.ного белка трихлоруксусной кислотой, 10В полученном Фильтрате определяютколичество прогицролизонанного белкапо содержанию образовавщегося тирозина колориметрическим методом с применением реактива 4 олина (1 (. 15Однако известный способ трудоемок,многостадие, за(лимает много времени.Наиболее блэким к предлагаемомуявляется способ определения актинности протеаз путем сонместного иеп(убирования люциферазы с исследуемойпробой с последующим измерением биолюминесценции инкубационной среды (2 ),Недостатком способа является отсутстние непрерывности процесса апре деления протеолитической активности,для измерения необходим многократныйотбор небольших по объему проб, чтонеизбежно приводит к большим ошибкамв определении активности протеаз.Кроме того, для определения протеолитической активности по известномуспособу необходима дополнительнаяграфическая обработка получае(лых данных, что вносит дополнительную ошибку,н определении величины протеолитичес-З 5кой активности и не позволяет антоматизировать этот процесс.Цель изобретения - ускорение ипонышение точности способа,Поставленная цель достигается 40согласно способу определения активности протеаз путем совместного инкубирования люциферазы с исследуемойпробой с последующим измерением биолюминесценции инкубационной среды,при котором в инкубационную смесьпредварительно вносят восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфланинмононуклеотид оксидоредуктазуи ее субстраты, а исследуемую пробудобавляют после установления стабильного уровня свечения,Способ осуществляется следующимобразомДля определения активности протеаэ сливают вместе люцифераэу,1(аРН,РМИ-оксидоредуктазу, альдегид,ГМБ и БаРН. Ьлагодаря избытку ИаРНи работе ЫаРН.ГМИ-оксидоредуктазысоздается стационарная концентрациясубстрата люциферазы-РЫКНг, как60следствие этого - стабильный уровеньсвечения, После добавления в полученную смесь протеазы наблюдаетсяпадение люминесценции, обуслонленноеииактинацией люциферазы под действием 65 протеазы. Падение люминесценции можно измерять непрерывно, без дополнительного отбора проб, если полученный образец инкубировать непосредственно в кювете прибора для измерения свечения, детекторной частью которого янляется ФЭУ, сигнал с ,которого подается на самопишущий потенциометр с известной скоростью протяжки масштабной ленты,Протеолитическую активность при этом определяют по константе инактивации люцифераэы, которую вычисляют по следующей формуле:где 1 (/2 - время, необходимое дляуменьшения биолюминесдентной актин -ности на 50, мин,Для учета неспецифической инактивации люциферазы измерение проводятв отсутствии протеазы. Активностьпротеазы определяют разностью междуконстантами инактивации люциферазыв присутствии и отсутствии протеазы,П р и м е р 1 . Используют нкачестве протеазы сухой препараттрипсина иэ поджелудочной железы быка с удельной активностью 40 ед, на1 мг препарата и частично очищенный препарат люциферазы из РЬооЬасег.цп( рйозр)(огец, содержащий иИаРН, "ГМИ-оксидоредук тазу,К образцу, содержащему 400 мкл 01 буфера, 20 мкл ферментного пре" парата (0,3 мг/мл люцифераза с аРН:РМК-оксидоредуктазой) 50 мкл ГМ б,б 10-5 М и 50 мкл 0,005% ного раствора миристинового альдегида, дсбавляют 300 мкл ИаРН 2,б 810 4 М, (После достижения стабильного уровня биолюминесценции (10 сек) добавляют 50 мкл раствора трипсина (конечнаякон 4 ентрация 12(5 (лкг/мл) . Измерение биолюминесценции проводят в термостатиронанной кювете при 30 С, Для учета неспецифической инактивации люциферазы проводят экспериментбез добавления трипсина.Константу иактивации люциферазы рассчитывают по формулеРп 21 гКонстанты инактйвации люциферазы В отсутствии и Б присутствии трипсина составляют 4, б 2.10 гмин-" и 2,31 мин, соответственно, Аналогии- но подсчитывают константы инактивации для других концентраций трипсина,Предлагаемый способ обеспечивает непрерывность процесса измерения, упрощается процедура в целом и позы1027615шается точность определения актИв- +5, что в два .раза меньше ошибки;ности протеаз, при атом константыйолучаемой в известном способеинактивации определяются с точностью (+10 Ъ)Составитель С. Малютина Редактор С. Юско Техред С,Мигунова Корректор А. Повх Заказ 4730/48 Тираж 873 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5Филиал ППП Патент, г, уигород, ул, Проектная, 4