Способ количественного определения целлюлозы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСРЦИАЛИСТИЧЕ 01 ИХРЕСПУБЛИК 9) (11) За) а 01 Б 33 46 а 12 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1 У Ь,а, г)г)10 ь :)дт щ ИДЕП:ЛЬСТ ВТОРСНОМУ(71) Научно-исследовательский институт химии при Горьковском орденаТрудового Красного Знамени государственном университетеим, Н,И.Лобачевского(56) 1. ЗсЬгашш М.,Нев 1 хп ц 1,.А поче 1 шейЬой 1 ог 1 Ье йе 1 егш 1 па 1 опо 1 се 11 ц 1 оее, - В 1 осЬеш.,), ч, 56,р. 163, 1954.2. Авторское свидетельство СССРР 826233, кл. О 01 Н 33/46 1981(прототип),( 54)(57) СПОСОб КОЛИЧЕСТВЕННОГООПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЛ 10 ЛОЭЫ путем обработки анализируемой пробы целлюлоэо-гидролиэующим ферментным препаратомс последуюцей обработкой полученнойсмеси реактивом Шамоди-Нельсона испектрофотометрированием окрашенногораствора, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью снижения пределаобнаружения и упрошения технологииопределения, пробу предварительноразмалывают и обработку осуцествляют,ферментным препаратом, выделеннымиз культуры Оео 1 г 1 сИцш сапй 1 йцш Зс,прн рН 4,0-4,8 и 45-50 С.Изобретение относится. к аналитической химии, а именно к способам количественного определения целлюлозы.Известен способ определения малых количеств бактериальной целлюлозы, основанный на ацетолизе предварительно очищенного образца, кислотном гидролизе полученного продукта и ко лориметрическом определеиии всЖ:тй, навливающих.сахаров с медным реаген том 1 3Недбстатки способа - длительность и сложность обработки, недостаточная ,избирательность и высокий предел обнаружения. 15Наиболее близким к предлагаемому является способ количественного определения целлюлозы и целлюлозных микроорганизмов путем обработки анализируемои пробыфильтратом культураль 20 йой жидкости бактерии Яог, ое 11 п 1 оеии при рН 3-5 и 40-45 оС с последующим спектрофотометрическим определением образующихся в результате ферментативногс гидролиза Редуцирующих веществ методом Иамоди-Нель. сона (.23.Однако способ обладает недостаточно низким пределом обнаружения (0,01 мг/мл), сложностью и длительностью подготовительных операций (необходимость, постоянного культивирования культуры Яог, се 11 и 1 овив).Цель изобретения - снижение предела обнаружения и упрощение технологии определения; 35Поставленная .цель достигается согласно способу количественного определения целлюлозы путем обработ. ки анализируемой пробы целлюлозогид ролиэующим ферментным препаратом с 40 последующей обработкойполученной смеси реактивом Шомоди-Нельсона и спектро фотометрированиемокрашенного раствора, при котором пробу предварительно размэ лывают и обработку осуществляют 45 ферментным препаоатом, выделенным из культуры Оео 1 г 1 спппб сапй 1 йщп " 3 С при рН 4,0-4,8 и 45-50 С.Предварительная обработка анализируемой пробы приводит к переходу целлюлозы в легкогидролизуемое состояние, а использование ферментного препарата позволяет упростить и стан дартизировать процесс (активность ферментного препарата в течение длительного времени остается неизменной). Раствор ферментного препаратаиэ гриба Оеог 1 спцш сапйхйцш Зс Готовят, заливая навеску соответствующимобъемом ацетатного буфера (рН 4,0); интенсивно перемешивая ва магнитной бо мешалке (15 мин), затем центрифугируют при 8000 об/мин (15 мин). Готовят раствор в день определения.Раствор Шамоди готовят соединеНием четырех объемов раствора 1 (12 в 65Результаты для построения калибровочного графика приведены в табл. 1. Таблица 1 Оптическая плот- Содержание целность при 508 нм, люлозы, мг/мл3=0,5 см 0,05010 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 0,06 0,10 016 0,31 0,46 0,60 0,75 Результаты определения целлюлозыприведены в табл. 2,гартрата натрия, 24 г Иа СОЗ(безв. ),16 г БВ,НСОЭ, 14 г ИаЯО довести до800 мл водой) и одного объема раст.вора 2 2,4 г СиЯО 5 НйО и 3,6 гЯаЯО, в 200 мл воды).Реактив Нельсона готовят растворением 25 г молибдата аммония в450 мл воды, добавлением 21 мл концентрированной серной кислоты, 3 гмьпаьяковокислого натрия в 25 мл водыи доведением объема до 500 мл. Раствор перед употреблением выдерживают48 ч йри 37 оС. Хранится раствор втечение длительного времени,Построение калибровочного графикаопределения целлюлозы.В термостатированную при 50 Сячейку помещают порошок предварительно размолотой на вибромельнйце целлюлозы (0,005-5,00 мг) и заливают5 мл раствора ферментного препаратаОео 1 гспиж сапй 1 дитп Зс,В результате сухого размола на.вибрационной мельнице в .течение30 мин получают тончайший белый порошок с размером частиц до 200 мкм.Процесс ферментативного гидролиэапроводят при постоянном перемешивании в течение 1 ч (время контролируют с точностью +10 .с). Растворцентрифугируют при 8000 об/мин втечение 10 мин, отбирают 1 мл раствора и определяют образовавшиеся,редуцирующие вещества по методикеМамади-Нельсона.На чертеже представлен калибровочный График зависимости образоВавшихся в результате ферментативногогидролиза редУцирующих веществ (пооптической плотности окрашенногораствора) от содержания целлюлозь1027614 Таблица 2 Таблица 3 Пределы обнаружения, мг/мл Температура, 0 С Целлюлоза, мгрмл ШУ ВВв еде но НайденоФеей5 20 0,001+0,00010,022+ О, 0020,051+0,0040,10+0,007 0,10 - 1,20 0,05 - 1,15 0,02 - 1,10 0,001 - 1,00 0,001 - 1,00 0,020,70 0001 0,020 0,050 0,10 0,20 0,50 0,70 1,00 30 40 0 45 50 0,21+ О, 01 0,48+0,03 0,72+0;04 1,04+ 0,09 60 4Наибольшая чувствительность имаксимальный диапазон определяемыхсодержаний обеспечиваются при проведении процесса при 45-50 С.П р и м е ч а и и е. 6,а(0,95. Ю П р и м е р 3. Способ осуществлюется по примеру 1, но при проведенииП р и м е1. В термостатиро- ферментативного гидролиза варьируютванную при 50 С ячейку помещают 1 мг РН среды от 3,6 до 6,0 .порошка предварительно размолотой Зависимость пределов обнаруженияна вибромельнице целлюлозы, заливают 25,целлюлозы от рН среды при проведении5 мг раствора фермента (рН 4,0, ферментативного гидролиза показана0,2 мг/мл целлюлозы) и проводят фер- в табл. 4,ментативный гидролиэ в течение 1 ч Таблица 4при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки (продолжи- рН Пределы обнаружения,тельность гидролиза контролируют се- мг/млкундомером ).Раствор центрифугируют при8000 об/мин 10 мин и определяют ре,85дуцирующие вещества, С этой целью1,00к 1 мл раствора добавляют 1 мл раствора Иамоди и.кипятят смесь на водя,00ной бане 15 мин. Охлаждают и добав 1,00ляют 1 мл реактива Нельсона, доводятдистиллированной водой до 10 мл и 0,90после перемешивания колориметрируют400,80на спектрофотометре СФпри 508 нмв кювете с длиной грани 0,5 см. Раст 6,0 0,75варом сравнения служит вода, прошедшая ту же обработку, Оптическаяплотность (0,16), определенная этимспособом, соответствует 0,2 мг/млцеллюлозы (согласно ранее построен- Из табл. 4 следует, что рН 4,0 ному калибровочному графику). 4,8 при проведении ферментативногоП р и и е р 2, Способ осуществля- гидролиза обеспечивает максимальныйют по примеру 1, но при проведении 50 диапазон определяемах содержаний иферментативного гидролиэа варьируют наибольшую чувствительность,.температуру от 30 до 60 фС. Предлагаемый способ позволяетЗависимость пределов обнаружения снизить предел обнаружения целлюлозыцеллюлозы от температуры проведения с 0,01 мг/мл (известный способ) доферментативного гидролиэа показана в 55 0,001 мг/мл и упростить технологиютабл, 3, определения целлюлозы.Составитель А. ВакулаТехред Т. фанта 0,01 0,001 0,001 0,001 0,01 0,01 0,01 3,6 4,0 4,4 4,8 5,2 5,6 Редактор С. Юско Тираж 873 Заказ 4730/48 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4