Способ определения активности липопротеидлипазы

102323 01 к зз ГОСУДАРСТВЕННЬЙЙО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕН ОТНРПЪЙИЗОБРЕТЕНЙЯ , .и ИВЪС У К АВТОРСКОМУ(21) 329816830-15 . (54) (57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВ- (22) 11,06.81 , НОСТИ ЛИПОПРОТЕИДЛИПАЗЫ, включающий .(46) 15.06.83, Бюл В 22 инкубнрование исследуемого материала с суб- (72)С; Н. Антон, Г. О. Шайхаев, В.М. Газдаров .стратом и акцептором ллрных кислот, экстраги. и В. И. Зверева . рование, окрашивание продуктов реакции и коло.риметрирование, о т л и ч а ю щ и й с я(71). Всесоюзный научно-исследовательский; тем, что, с целью упрощения способа и снижения институт физиологии, биохимии и питания сель-; .потерь фермента, ннкубнрованне проводят в :скохозяйственных животных ..течение 15-20 мнн с использованием в качестве (53),543.4(088,8)субстрата активнрованной жировой змульсиилипофунднна,(56).1.Мауеа Р. А. ат а 1., ТЪа гцпсбопа 1 2. Способ по п, 1, о т.л и в щ яеСатца оу Орорготаа Ораве е Эат Обжег.. тем, что в качестве исследуем атер .91 осЬее д., 1968, 108, р. 483, рут 0,75-0,80 мл гомогената2. ВатЬ) О. С, ат а 1. Соараг 1 аоп о 1 Оро; ткани в разведении 1:5, а в к бстратаргойеЬ Ораве АстЬЮез 1 п ОЫс 1 сапа ае 1 Тцг- используют 0,25-. О,ЗО мп 2%-н ора акти 1 йеуа гц 1 тгу Вс; 1979, 58 3, 659, - вированной жировой змульсии липофунднна. ч а ого мийснала беровой свежел жн ачестве су ого раста М САР ООинкубирование исследуемого материала с субстратом н акцептором жирныл кислот, экстрагнрование, окрашивание продуктов реакциии колориметрование, инкубирование проводятв течение 15-20 мин с использованием в качестве субстрата активированной жировойэмульсии липофундина.В качестве исследуемого материала берут 0,75 - 0,80 мл гомогената свежей жировой ткаиспользуют 0,25 - 0,30 мл 2%-ного раствораактивированной жировой эмульсии липофундина.П р и м е р, Принцип способа, как и впрототипе, состоит в определении прироста15 жирных кислот, отщепившихся от субстрата входе инкубации под действием фермента - ЛПЛ,колориметрическим методом,Общая схема способа сводится к следуюше.му, К 0,25 - 0,30 мл актнвированной эмульсии липофундина .прибавляют 0,25 мл0,1 М СаС 1 и 0,75 - 0,80 мл гомогената свежейжировой ткани (в разведении 1:5) н инкубиру.ют при непрерывном встряхивании в течение15-20 мин, после чего к смеси добавляют,. 6 мл хлороформа и 2 мл смеси медного реа.2)гента, Интенсивно встряхивают, центрифутируюти колориметрируют против контроля при длинбволны 440 нм,Способ характеризуется тем, что в ннкуба.ционную среду вносят гомогенатсвежей жиро 30 вой ткани без приготовления ацетоновых порошков, в качестве субстрата используетсяжировая эмульсия липофундина, инкубацию проводят в течение 1520 мин при 37 С. Способ определения активности ЛПЛ осущеЬ твляется следующим образом.Жировую ткань тотчас восле убоя животного замораживают в мороэительной камере.Продолжительное (более 4-5 дней) хранение в замороженном виде не рекомендуется ввиду снижения активности фермента, В день прове дения анализа 1 г жировой ткани гомогениэи руют на холоде с 4 мл охлажденного до 24 С 0,05 М трис-буфера, рН 85 в стеклян. ном гомогенизаторе. В инкубационные пробирки, снабженные шлифами, вносят 0,25 мл жи. ровой эмульсии липофундина, предварительно активированной путем инкубации ее в течение 30 мин со свежей сывороткой крови в соотно. шенин 1:9 при 37 С я непрерывном встряхивании, добавляют 0,25 мл.0,1 М раствора СаС 1 з, 0,75 мл гомогената жировой ткани (в разведений 1:5) и инкубнруют 15 мин в водяной бане при 37 С и непрерывном встряхивании (80 движений/Мин) . В конце инкубации для экстрагирования жирных кислот в инкубационную смесь добавляют 6 мл хлороформа и 2 мл реагента, состоящего из 10 ч, 5,5%-ного нитрата меди, 9 ч, 1 М триэтаноламина и 1 ч, 1 н, 1023238 йИзобретение относится к биологической химии, в частности к методам определения пилонпротеидлипазной активности в жировой ткании другом биологическом материале, и можетбыть использовано в лабораторной практикепри изучении липндного обмена.В настоящее время получили широкое распространение ряд методов определения актив.ности липопротеидлипазы (ЛПЛ) с использованием в качестве субстрата фирменных образцов 10 ни в разведении 1:5, а в качестве субстратаэмульсии масел, таких как эдиол и интралипнд. Все они основаны на количественном определении прироста жирных кислот, отщепивнщхся от субстрата под действием ЛПЛ, путемтитрования или колориметрирования, Наиболееудобным при этом является метод непрерывного титрирования с использованием рН.стата,снабженного автоматической микробюреткойи самописцем, Учитывая то, что дорогостоящиекоммерческие приборы исключают возможностьего широкого применения, в практике чащевсего используют какой-либо иэ обычных методов титрования 1).Этот метод не всегда является точным, таккак при этом трудно уловить конец титрова.ния,Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активности ЛПЛ, исполь.зованный в анализах жировой ткани птицы.Способ основан на анализе комплексных соеди.нений свободных жирных кислот с медью после экстракции их органическими растворителя-ми и предусматривающий определение количестважирных кислот в инкубате колориметрическимметодом. Схема этого способа включает приготовление ацетоновых порошков иэ жирнойткани, гомогениэацию их в 0,025 н. 1 чНз, инку.бацню в течение 60 мин при 37 С 1 мл суспензии ацетонового порошка в инкубационнойсреде, содержащей юрис буфер (1,35 М,рН 8,1), 1,5 мл 15%.ного бычьего альбумина 465.й фракции в 0,15 М йаС 1, 0,2 мл субстрата(интралипида), активироваиного свежей сы-.вороткой крови, и 0,3 мл 0,15 М йаС 1, экс.трагпрование, окрашивание и колориметрирование 21,45Недостатками этого способа являются тру.доемкость и дополнительный расход химреак-тивов, обусловленные необходимостью прито.товления ацетоновых порошков исследуемыхтканей, а также частичная потеря активностифермента при проведении этой операции и большая .продолжительность (60 мин) инкубацииферментного препарата с субстратом. В качестве последнего используется жирвоая эмульсияинтралипид (ЧИгцв, Стокгольм, Швеция).Целью изобретения является упрощение55способа и снижение потерь фермента.Цель достигается тем, что согласно способуопределения активности ЛПЛ, включающемуПрелагаемый способ апробирован в лаборато.рии онтогенеза ВНИИФБиП сельскохозяйствен-,ных животных.В таблице приведена сравнительная эффек;тивность предлагаемого способа определенияактивности ЛПЛ в свежей жировой тканипоросят цо отнощению к прототипу.мя инкубации времени на приготоетонового порошкаотипу), ч 3 атратьление(по про Не требуется 2,5 - 3,0 Дополнительный расход химреактивов на приготовление 1-йпробы ацетонового порошка,мл: Ацетон Не требуетс Р Не требуется 25твительность, мкмоль/мл . 0,05 0,05 Из представленных данных видно, что ак все эти операции исключаются в виду того,тивность ЛПЛ в свежей жировой ткани по что используется свежая жировая ткань.предлагаемому способу значительно выше при 45пересчете на грамм ткани по сравнению с;, Положительным эффектом предлагаемогоацетоновым порошком по прототипу, а время способа является то, что при его осуществле.инкубации уменьшается в 3 раза, Затраты вре- нии исключается операция по приготовлениюмени на приготовление ацетонового пороппса ацетоновых порошков жировой псами, сокра.по прототипу составляют 2,5 - 3,0 ч (включаю- щается время (на приготовление порошков иШий 5-7 мин на гомогенизацию жировой ткани инкубапюо) и исключаются затраты некоторыхв холодном ацетоне, фильтрование, промывка химреактивов (ацетона и эфира), а времяи" высушивание порошка на воздухе 2,5 - , инкубации составляет 15-20 мии вместо 60.3,0 ч), а дополнительный расход химреактивов Активность фермента в свежей жировой тканина 1 пробу составляет 100 мл ацетона и55увеличивается почти в 2 раза по отношению25 мл эфира, тогда как в предлагаемом способе к таковой в ацетоновых пороппсах.ВНИИПИ Заказ 4202/29 Тираж 873 ПодписноеФилиал ППП "Патент", г. Ужгород, улЛроектная,4 3 , 102323 уксусной кислоты, Интенсивно (240 движений/мин) встряхивают на механическом встряхивателе в течение 30 мин, затем центрифуги.руют 30. мин при 1000 ц/мин, Верхнюю фазу, окрашенную в синий цвет, отсасывают пипет..кой с помощью насоса, а 4 мл нижней фазы, содержащей высвобожденные в ходе реакции.жирные кислоты, переносят в обыкновенные стеклянные пробирки, Туда же добавляют 0,5 мл 0,1%-ного раствора диэтилдитиокарбо мата, Интенсивность окраски реакционнойсмеси определяют на электрофотоколориметре в кювете 1 см при длине волны 440 нм против контрольной пробы, Контрольная проба содержит все те же компоненты, что и опытная, только инкубацию субстрата проводят без ферментного препарата, а ферментный препарат (гемогенат свежей жировой ткани) вносят в инкубационную среду после добавления хлороформа и медного реагента, Количество жир 8 4ных кислот, образовавшихся в результатеферментативного расщепления субстрата, определяют по стандартной калибровочной кривой,Построение калибровочной кривом осуществляется следующим образом: к 1 мл растворапальмитиновой кислоты, содержащего в этомобъеме 0,1-1,0 мкм пальмитиновои кислоты,прибавляют 6,0 мл хлороформа, 1,25 мл водыи 2 мл медного реагента и далее все операциипроводят описанным способом, АктивностьЛПЛ выражают в мкмолях жирных кислотмин/г сырой жировой ткани,