Способ диагностики инфаркта миокарда

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК А 1 301381 САНИЕ ИЗОБРЕТ институтСРинститут чкин,В. С. Ар и лабо - Соф и 6 ы,АРК едицинскои иагностики ения - поМ ОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ СССР О ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Научно-исследовательскиймедицинской энзимологии АМН Си 2-й Московский медицинскииим. Н. И. Пирогова(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИТА МИОКАРДА(57) Изобретение относится к мэнзимологии, предназначено для динфаркта миокарда. Цель изобрет 4 А 61 В 10 00 С 12 М 9 88 С 12 1 вышение точности способа за счет определения активности альдолазы типа А в сыворотке крови. Для этого в сыворотке крови пациентов определяют активность альдо- лазы типа А инкубацией пробы в присутствии эритрозо-фосфата (Э 4-ф) и диоксиацетонфосфата в концентрации 0,55 - 1,1 мМ. Затем осаждают белок, к безбелковому супернатанту добавляют орциновый реагент, содержащий хлорное железо. Образовавшийся окрашенный комплекс экстрагируют хлороформом, спектрофотометрируют, по величине оптической плотности определяют количество, гептулозы в пробе и активность альдолазы типа А, значение которой пропорционально приросту гептулозы за единицу времени. При уровне альдолазы типа А в пробе сыворотки крови выше 8,1 Ед/л диагностируют инфаркт миокарда. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.Изобретение относится к медицинской энзимологии и может быть использовано для диагностики инфаркта миокарда.Цель изобретения - повышение точности способа за счет определения активности альдолазы типа А в сыворотке крови.Способ осуществляется следующим образом. В сыворотке крови кардиологических больных определяют активность альдолазы типа А и при ее уровне выше 8,1 Ед/л диагностируют инфаркт миокарда. Для определения активности альдолазы типа А разработан чувствительный способ, согласно которому пробу сыворотки крови инкубируют в присутствии эритрозо-фосфата (Э 4-Ф) и диоксиацетонфосфата (ДАФ) в концентрации 0,55 - 1,1 мМ, осаждают белок, к безбелковому супернатанту добавляют орциновый реагент, содержащий хлорное железо, образовавшийся окрашенный комплекс экст 10 15 рагируют хлороформом, спектрофотометриру 20 ют, по величине оптической плотности определяют количество гептулозы. в пробе и активность альдолазы типа А, значение которой пропорционально приросту гептулозы за единицу времени. 25 Этот способ предусматривает проведеиие реакции Э 4.ФЛАФ --- е гептутипа Алозо 1,7-дифосфат. Способ учитывает условия протекания ферментативной реакции в 30 ткани миокарда и сыворотке крови в норме и при инфаркте миокарда.Пример 1. Определение активности альдо- лазы типа А в сыворотке крови практически здоровых людей. Получение сыворотки: у практически здоровых людей берут 5 мл крови из локтевой вены без добавления консервантов, центрифугируют дважды при 3000 д/мин в течение 20 мин. В исследовании используется 1,5 мл сыворотки (по 0,5 мл для двух параллельно исследуемых образцов, 0,5 мл - контроль). Сы воротка, используемая для анализа, должна быть лишена следов гемолиза, может храниться при +2, +4 С до 4-х суток или длительное время при - 17 С (без размораживания).Проведение ферментативной реакции. 45 Состав инкубационной пробы: 0,5 мл сыворотки крови, 0,55 в 1,1 мМ Э 4-Ф 0,55 - 1,1 мМ ДАФ 100 мМ триэтаноламинНС 1 буфера рН 7,6. Общий объем пробы 2,7 мл, Инкубацию проводят 60 мин при 37 С. Реакцию останавливают грибавлением 0,3 мл насыщенного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), Центрифугирование при 3000 - 5000 д 20 - 30 мин.Обработка ТХУ-фильтрата реактивом орцин-ГеС 5, В пробирку с притертой пробкой отбирают 2 мл ТХУ-фильтрата (критический объем пробы), добавляют 0,4 мл концентрированной соляной кислоты. Пробирку помещают в кипящую водяную баню на 80 мин,после чего ее быстро охлаждают под водопроводной водой до комнатной температуры. Прибавляют 0,1 мл 0,052 Я-ного раствора ГеСЬз 6 НО на 4 Н соляной кислотеи 0,1 мл 12 Я-ного спиртового раствора орцина (готовится перед употреблением).Пробу перемешивают и вновь помещают вкипящую водяную баню на 3 мин, охлаждают.Экстракция хлороформом и определениеоптической плотности. К пробе прибавляют1,5 мл хлороформа, экстракцию окраски хлороформом проводят путем встряхивания образца ручным или механическим способом втечение 3 - 5 с. Содержимое пробирки переливают в обезжиренную, ополоснутую хлороформом спектрофотометрическую кювету на3 мл с длиной оптического пути0 мм.Расслоение хлороформа и водной фазыпроисходит быстро. Окраска (синяя) развивается сразу, устойчива во времени. Измерения проводят при длине волны 660 нм.В связи с небольшим объемом исследуемого образца для измерения коэффициентапропускания используют прилагаемую кспектрофотометру диафрагму. Кюветы в кюветодержателе поднимают с помощью подкладки (1 Х 1 см), изготовленной из тефлона, резиновой пробки или другого материала. Состав и обработка контрольныхпроб так же за исключением того, что ТХУдобавляют раньше внесения сыворотки.Приготовление стандартного раствора.10 мг ангидрида гептулозы растворяют в100 мл 5 Я-ной ТХУ. Для построения стандартной кривой используют образцы, содержащие 5,0 - 200 мкг ангидрида гептулозы,достаточно 3 - 4 образца. Этим методом можно определять как нефосфорилированнуюформу гептулозы, так и ее фосфорноепроизводное. Стандартные образцы, холостую пробу на реактивы обрабатывают также, как опытные и контрольные пробы.Доверительная чувствительность метода0,05 мкмоль гептулозы в пробе. Полученные данные выражают графически, откладывая по оси абсцисс количество гептулозы (мкг) в пробе, а по оси ординатвеличину оптической плотности, которая емусоответствует.При построении стандартной кривойпо ангидриду гептулозы не наблюдается отклонений от закона Бера.Порядок расчета. Измеряют оптическуюплотность опытной и контрольной проб, покалибровочному графику определяют содержание гептулозы в пробах. Высчитываютразницу в ее содержании между опытнымииконтрольными пробами (Л мкг).Для выражения активности фермента вмеждународных единицах Ед/л (мкмоль/лКХмин) используют формулуЕд/л =Л м кгХ 0,26,где 0,26 - коэффициентпересчета.1301381 3Коэффициент пересчета получают следующим способом,Полученные данные (разница между опытной и контрольной пробы) умножают на 2000 (для пересчета на 1 л сыворотки); умножают на коэффициент , который зави 5 сит от количества отобранного ТХУ-фильтрата из 3 мл общего объема пробы. При отборе из 3 мл общего объема пробы 2 мл Таблица 1 Сыворотка Субстратыкрови,мл реакции,мМ Данные по расчету активности птическая мкг Ьмкг Ед/ллотность ыт Э 4-Ф 38,5 б,5 троль 0,05 АФ 0,7 Опыт Э 4-Ф 0,55 О,б,2 онтроль ДАФ 0,55 влены данные по опальдолазы типа А в тически здоровых люи различных концентние активности альдоотке крови больного Больной Д., 51 год, был доставлен в клинику с жалобами на жгучие боли за грудиной, удушье, выраженную слабость. Боли 4 за грудиной возникли впервые в жизни в день госпитализации, длительность их превышала 1 ч, эффекта от нитропрепаратов В табл. 1 предста ределению активности сыворотке крови прак дей при использовани раций субстратов.Пример 2. Определе лазы типа А в сывор инфарктом миокарда. ТХУ-фильтрата коэффициент 1 равен 1,5; затем делят на 60 (для выражения активности в 1 мин) и делят на 192 - молекулярный вес ангидрида гептулозы - моногидрата (для выражения активности в микромолях) . Отсюда активность равна Л мкгХ 0,26, Для нормальной сыворотки крови активность альдолазы типа А 6,02+- 0,5 Ед/л. не отмечено. Боли купированы введением наркотических анальгетиков.На ЭКГ при поступлении выявлялись признаки крупноочагового инфаркта миокарда нижнедиафрагмальной локализации. Уровень аспартаттрансаминазы 54 Ед (при норме 45 Ед), креатинфосфокиназы 0,5 Ед (при норме 0,5 Ед). Активность альдолазы типа А (определяли как в примере 1) в 1, 2, 3, 4, 5 и 8 дни заболевания составила соответственно 24, 60, 48, 27, 30, 9 Ед/л. Величины активности отличались от аналогичного показателя у больных ишемической болезнью сердца, что позволило подтвердить диагноз острого инфаркта миокарда.1301381 Таблица 2 Опыт 0,790Контроль 0,5 Э 4-Ф 0,55 103 ДАФ 0,55 0,08 10 93 24,2 Опыт0,750Контроль0,075Опыт0,750Контроль Э 4 - Ф 0,7 0,5 98 ДАФ 0,7 10 88 22,88 Э 4-Ф 1,1 0,5 0,06 ДАФ 1,1 12,66 91 В табл. 2 представлены данные по определению активности альдолазы типа А в сыворотке крови больного инфарктом миокарда при использовании различных концентраций субстратов.Для уменьшения погрешности в измерении активности альдолазы типа А при показаниях оптической плотности более 0,8, что бывает в случае крупноочагового инфаркта миокарда, используют 0,2 мл сыворотки крови (вместо 0,5 мл) или цельную сыворотку крови разводят 100 мМ триэтаноламин НСь буфером рН 7,6 в 2,5 - 5 раз, и определение активности повторяются.Пример 3. Определение активности альдо- лазы типа А для диагностики инфаркта миокарда у больной без убедительных электрокардиографических данных.Больная Р., 73 года, доставлена в стационар с жалобами на интенсивные разрывающие боли в области сердца длительностью более 30 мин. В анамнезе - артериальная гипертония более 5 лет. На ЭКГ, снятой в блоке интенсивного наблюдения, убедительных данных за острый инфаркт миокарда не было. Не отмечено также повышения уровня аспарагиновой и аланиновой трансаминаз. Определение активности альдолазы тигга А проводили в 1, 2, 3 и 4 дни заболевания, ее уровень составил соответственно 30, 45, 30, 36 Ед/л. По данным определения активности альдолазы типа А был подтвержден диагноз инфаркта миокарда. На 11-й день на фоне острой сердечной недостаточности больная скончалась.При патологоанатомическом исследовании диагноз инфаркта миокарда был подтвержден, Таким образом, при отсутствии электрокардиографических и других лабораторных показателей инфаркта миокарда определение активности альдолазы типа А позволило диагностировать инфаркт миокарда. Диагноз был верифицирован при патологоанатомическом исследовании,Пример 4. Определение активности альдо 4 О лазы типа А у больного при отсутствиипризнаков некроза в миокарде.Больная 3., 54 года. Поступила в клинику с жалобами на боли за грудиной сжимающего, давящего характера, удушье. Длительность болей не превышала 15 мин, 45 боли купировались приемом нитроглицерина,На ЭКГ данных за острый инфаркт миокарда не было. Активность аспартаттрансаминазы в пределах нормальных показателей.Таким образом, на основании данных клиники, электрокардиографических показате лей диагноз острого инфаркта миокардабыл исключен. Активность альдолазы типа А 6,5 Ед/л, что также указывало на отсутствие острого некроза в сердечной мышце. У больной при Я-обследовании выявлен остеохондроз шейно-грудного отдела позвоночника, что усугубляло болевой синдром в области сердца, но не оказывало влияния на активность альдолазы типа А. Опреде130138 Таблица 3 Максимальный 10 Диагноз больных уровень активности альдолазы типа А, отмеченный у данной группы больных (М+26)Ед/л 7,02 Практически здоров 20 Остеохондроз шейногрудного отделапозвоночника 6,05 5,8 Стенокардия покоя 25 Стенокардия напряжения, Функциональный класс: 6,48 30 Формула изобретения 7,3 8,12 Инфаркт миокарда, день заболевания: 24,42 24,7 23,67 21,13 11,12 10,3 9,87 Составитель Н. ГуляеваРедактор И. Горная Техред И. Верес Корректор М. СамборскаяЗаказ 921/3 Тираж 596 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий13035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 415Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ление активности альдолазы типа А у данной больной позволило отказаться от диагноза острого инфаркта миокарда и расширило диапазон обследования больной. Результаты обследования позволили назначить адекватное лечение в связи с выявленным заболеванием. В табл. 3 представлены усредненные данные по активности альдолазы типа А в сыворотке крови практически здоровых людей и больных. 35 40 45 50 Таким образом, в течение 7 д;:ей активность альдолазы типа А у больных инфарктом миокарда превышает уровень 8,1 Ед/л, максимальный для больных ишемической болезнью сердца, стенокардией напряжения и покоя, что и позволяет использовать данный тест для диагностики некроза сердечной мышцы.Преимущества предлагаемого способа диагностики инфаркта миокарда путем измерения активности альдолазы типа А заключаются в том, что при определении активности учитывают свойства фермента в миокарде и сыворотке крови, Это позволяет повысить диагностическую чувствительность способа.Повышение химической чувствительности определения продукта реакции альдолазы типа А гептулозо,7-дифосфата в 3 раза особенно важно при необходимости установления дифференцированного диагноза между случаями с минимальными некротическими изменениями в миокарде и случаями без некроза миокарда, Все это позволяет использовать способ в условиях клиники для диагностики острого инфаркта миокарда и подтверждения диагноза инфаркта миокарда в случае наличия характерных изменений на электрокардиограмме, а также отдифференцировать инфаркт миокарда от хронических форм ишемической болезни сердца. 1. Способ диагностики инфаркта миокарда путем определения активности фермен. та в сыворотке крови больного, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, в сыворотке определяют активность альдолазы типа А и при ее уровне выше 8,1 Ед/л диагностируют инфаркт миокарда.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения активности альдолазы типа А в сыворотке крови, пробу сыворотки инкубируют в присутствии эритрозо-фосфата и диоксиацетонфосфата в концентрации 0,55 - 1,1 мМ, осаждают белок, к безбелковому супернатанту добавляют орциновый реагент, содержащий хлорное железо, образовавшийся окрашенный комплекс экстрагируют хлороформом, спектрофотометрируют, по величине оптической плотности определяют количество гептулозы в пробе и активность альдолазы типа А, значение которой пропорционально приросту гептулозы за единицу времени.