Способ определения устойчивости хлопчатника к вилту

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских(22) Заявлено 12. 0980(21) 2983094/30-15 с присоединением заявки НоР 1 М Кт з А 01 Н 1/04 Госуяарственный комитет СССРпо делам изобретений и открытийОпубликовано 150133. Бюллетень М 2. Дата опубликования описания 15, 01. 83 2 К.Алиев, Ю.С.Насыров, М Анварова и Г.В.фрагиьюва-. ,Институт физиологии и биофизики растенийАН Таджикской ССР(54) СПОСОЙ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОИЧИВОСТИ ХЛОПЧАТНИКАК ВИЛТУ(Изобретение относится к селекциина иммунитет к,боЛезняМ и может бытьиспользовано в сельском хозяйстве.Известен способ определения устойчивостихлопчатника к вилту, прикотором перед посевом хлопчатникапроизводят заражение почвы возбудителем данного заболевания Г 1).Однако данный способ требует боль(1ших затрат времени и труда и не всегда приводит к .желаемым результатам,так как проявление заболевания в ес. тественных условиях зависит от почвенно-климатических условий.Известен также способ определенияустойчивости хлопчатника к вилту, прикотором проводят гибридизацию молекулДНК, вьцеленной иэ хлопчатника с ме"чвнной ДНК-С 1 , полученной из возбу(1днтеля вилта хлопчатника и по степени гибридизации судят о степени устойчивости 12.1Данный способ не позволяет получатьнеповрежденную ДНК иэ растений, авысокая гибридизуемость между ДНКхлопчатника и гриба затрудняет опре-,деление вилтоустойчивости.Цель изобретения - ускорение определения вилтоустойчивости и повышение его точности,2зПоставленная цель достигается тем, 4 то проводится реакция аминоацетилирования тРНК-ФврментОм аминоацил-тРНК-синтетазы,выделенной на разных по устойчивости сортов и поза-. меняемости ферментов определяют степень устойчивости к заболеванию. Таким образом проводят выделение тРНК из устойчивых к вилту сортов хлопчат" ника и аминоацил"тРНК-синтетазы ив неустойчивых и по заменявмости ферментов судят о степени устойчивости к заболеванию.П р и м е р .100 г эамоченных в бидистиллированной воде семян растйрают в ступке с 200 мл 0,05 М ацвтат ного буфера, рН 7,0 содержащего 1 мг/мл бентонита, 0,03 МсСРд, 0,01 И меркаптозтанола до гомогенной массы. Гоогентат центрифугируют 40 мин при 20000 об/мин, к надосадочной,жидкости добавляют додецилсульфат натрия (539) до конечной концентрации 0,5%-ной и равное количество водного фенола и перемешивают при комнатной температуре 20 мин. Водную 4 азу,отделяют цент рифугированивм 10.мин. прй 5000 об/мин, обрабатывают смесью. хлороформ-,иэоами988244 жащвй 100 мкМ трмс -НСВ буФере рН 7.3,15 мкм Ксоли АТФ, 20 мкм МСЕ 2.мкМ 2-меркатозтанола. Конечный объем 1 мл.6Инкубацию проводят 10 мин при 30 СРеакцию останавливают добавлением 0,1 мл 20-нойс,трихлоруксусной кислоты и осйждают тремя объемами спирта. Осадок отделяют центрифугированием,10 мин при 3000 об/мин.Осадок промывают 70-ным холодным спиртом 10 раэ, растворяют 10-ным раствором ИаСР и пропускают через колонки с свфадексом Г(размер колонки 300 ммф 12 мм). Радиоактив" ность проб просчитывают на диаксановом сцинтиляторв-счетчике МАРКПроцент заменяемости фермента определяют. по степени аминоацилирования тРНК устойчивогосорта. Ташкент 1 ферментом 108 Ф и С 4727, т.е, по уровию включения С" "серина в акцепторную часть тРНК этими ферментами. данные, приведенные в таблице показывают, что фермент из восприимчивых сортов (108 Ф и С 4727) имеет процент эамвнявмости от 30 дд 50, а фермент иэ устойчивого сорта Ташкент 1 - 80-90, т.е. фермент иэ невосприимчивого сорта, почти полностью ацилирует тРНК восприимчивых ,сортов. Такимобразом, фермент неустойчивых сортов не апособен полностью ,ацилировать тРНК уатойчивого сорта Ташкент 1, что указывает на репреасивность генома семян, ответственного за кодирование определенных иэоформ аминоацил тРНК синтетазы специфичные к серину. В таблице представлена активность аминоацил"тРНК-синтетаз в реакции аминоацилирования серил-тРНК,Предлагаемый способ позволяет точно и быстро определить устойчивость хлопчатника к вилту в лабораторных условиях на уровне се" мян. Источник выделения Удельная активностьтРНК, нмп/мин мг РНК Аминоапил-тРНКСинтетаэ тРНК Сорт,Сорт Ташкент28,200 11 ашкент"1 108-Ф С727100 26.250 108-ФС100 18,250 100 с лоя осаждают РНК добавлением 2,5Объема холодноГО спирта и оставляют иа ночь для формирования осадка, РНК ьтделяют центрифугированием 10 мин при 4000 об/мин, промывают несколько :раз холодным спиртом,. осадок РНК раст" 5 воряют в воде, содержащей 10-ный Р)а)СЗ и оставляют на несколько часов дляЪормирования осадка. Выпавший осадок РНК выделяют центрифугированием 10 мин ,при 4000 об мин. К надосадочной жидости снова добавляют 3 объема холодо спирта. Осадок тРНК собирают цвнтрифугированием, как указано выне, тРНК растворяют в холодной воде и добавляют 1"иый ЙвОН до рН 10,0 и ин- )5 кубируют при 37 фС 1 ч для освобождения тРНК от аминокислот. Раствор тРНК нейтрализуют 1 М СНСООН на хо" лоде н очищают на колонке с свфадвксом (Г)ьминоацил-тРНК"синтвтазы получают гомогенизированнвм семян хлопчатника в 0,025 Моррис -НСИ , буфере рН 7,5, содержащем 0,01 М 10-ный глицерин 0,01 М мвркапозтанола (на 100 г семян добавляли 200 мл буфера) и центрифугируют 20 мин при 20000 об/мин, Надосадочную жидкость снова центрифугируют 60 мин при 40000 об/мин. К надосадочной жидкости добавляют сухой сульФат. аммония до 17-ного на- З 0 сыщения, Осадок отделяют центрифугированием 20 мин при 15000 об/мин.надосадочной жидкости медленно в течение 2 ч добавляют сухой сульфат аммония до 37-ного насыщения и ос тавляют на 2-4 ч для Формирования осадка. Осадок отделяют центрифугированием 20 мин при 1500 об/мин растворяют в вышеуказанном буфере и освобождают от примесей путем диалиэа на ночь. Фермент концентрируют с полощью сефадекся Г.Реакцию аминоацнлирования проводят следующим образом. 0,5 мл тРНК (0,2 мг) ннкубируют с 0,1 мл аминоацил-тРНК-синтетазой (0,1 мг) в при сутствии МС-серина в среде, содерЗаменяемость фермента,98844 Продолжение таблицы Удельная активностьтРНК, имп/мин мг РНК Мсточник выделения заменяемость фермента,Ъ108-ф 20.120 Ташке нт80 ТашкентС16,790 90 50 108-фСТашкент13.650Ташкент6.400 30 формула изобретения Составитель М.ДранишниковРедактор В,Ковтун Техред Е.Харитончик Корректор О,Билак Заказ 10911/3 Тираж 719 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/51филиал ППППатентф, г.ужгород, ул.Проектная,4 Способ определения устойчивости хлопчатника к вилту, включающий тестирование семян на возбудителе даннога заболевания, о т л и ч а ющ и й с. я тем, что, с целью ускорения процесса определения и повышения его точности, проводят реакциюаминоацилирования тРНК-ферментом :аминоацил-тРНК-синтетаэы, выделенной иэ разных по устойчивости сортов и по заменяемости ферментов определяют степень устойчивости к эаболеванию. 25 Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Информационные фоны в фитопатологии, Научные труды ВАСХНИЛ, М.,Колос 1979 с, 104 105 а30 2. Авторское свидетельство СССРР 511917, кл. А 01 Н 1/02, 1974