Способ количественного определения циклических нуклеотидов

Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУво делам нзооретеннй и открытий(72) Авторы изобретения жа /-1-ый Московский ордена Ленина и ордена Трудового ра Знамени медицинский институт им. И, М., Сеченова(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Ш 4 КЛИЧЕСКИХ Н УКЛЕОТИДОВ1Изобретение относится к медицине ибиологии и предназначено для идентификации циклических нуклеотидов в биологических жидкостях и тканях.Известен способ количественного определения циклических нуклеотидов в биологичееком материале путем экстракциипробы спйртом, высушивания экстракта,ра/отворения осадка в буфере, инкубациипробы при 0 С в присутствии связываюо1 Ощего белка и меченого нуклеотида, фильтрования, отмывания несвязавшейся меткис цоследуюшим радиометрическим измерением количества циклических нуклеотидовГ 13Однако известный способ длителен повремени анализа,Цель изобретения в ускорение способа.Поставленная цель достигается тем,что при осуществлении способа количественного определения циклических нуклеотидов в биологическом материале путемэкстракции пробы спиртом, высушиванияэкстракта, растворения осадка в буфере,инкубвции пробы при 0 С в присутствиисвязывакипего белка и меченого нуклеотида, фильтрования, отмывания несвязвв;шейся метки с последующим рвдиометрическим измерением количества циклических нуклеотидов, инкубацию пробы проводят непосредственно на участке милипорового фильтра, покрытого гидрофобнымматериалом.Способ осуществляется следующим образом.П р и м е р 1. Определение содержания циклического3 5- аденозинмонофосфата (цАМФ) в тканискелетных мышц больного миопатиейЙюшена,Биоптат мьппечной ткани немедленнопогружают в жидкий азот, затем гомогенизируют в 3-5 мл кипящего этанола,центрифугируют при 5 ООО об/мин 15мин, упаривают досуха при 40 оС. Освдокрастворяют.в 0,5 мл буфера, содержвше, Изучение механизности вденилатпиклв, дис. М., МГУ,Источники принятые во внимв 1. Балденков Г мов регуляции актив зы гормонами., Ка 1979, Подпис ИИПИ квз 8507/35 Тираж 88 Патен уд, Проектная, 4 иад го 3го 5 мМ трис- НСГ, 0,4 мМ ЭДТА,рН 7,4. 15 мкл исследуемого образцапереносят на гидрофобное покрьггие милипорового фильтра, добавляют 15 мклН цАМФ и 30 мкл цАМФ-связывающегобелка, Инкубируют 30-45 мин при 0 С,Затем фильтры промывают хододным буферным раствором, содержащим 5 мМКН Р 04 и 0,5 мМ ЭДТА рН 7,4; высушивают, помещают в толуольный сцинтил- щлятор и измерякг уровень радиоактивности нв сцинтидляпионном счетчике,В таблице приведен расчет содержания ц/АМФ.Содержание пАМФ в образце опреде по формуле -- 1 К,( осхэффициент К (тангенс уг8К= = 43-1содержание цАМФ; В пересчете на мг белка, содержвше гося в пробе, концентрация цАМФ составила 3,52 пкмоль. При определении концентрации пАМФ известным способом расчеты проводятся аналогично и содержание нукдеотьща в данном образце ссста- Зо вило 3,7 пкмоль/мг белка.П р н м е р 2. Определение содержания циклического 3 5 гуан озинмонофосфвта35летных мьшш больногобоковым вмиотрофическим склерозом.Экстракцию цГМФ проводят так же как цАМФ. Затем 30 мкл исследуемого образца переносят нв тидроФ.бное покры тие милипорового фильтра, добавляют 15 мкл Н цГМФ и 15 мкл антисыворотки. Каплю инкубируют 30-45 мин при 0-2 оС. Дальнейшие операции аналогичны проводимым при определении пАМФ. Содержание нуклеотидв рассчитывают стандартным методом. Концентрация цГМФ, определенная известным способом, составила 1,56 пкмоль/мг белка а предлагаемым способом,61 пкмоль/мг белка.0 фИспользование предлагаемого способапозволяет без снижения точности умень 1шить количество используемых реактивови тем самым снизить стоимость анализав 3-4 раза. Одновременно сокращаетсявремя проведения анализа и трудоемкостьопераций,Способ количественного определения пиклических нуклеотидов в биологичесм материале путем экстракпии пробыиртом, высушиввния экстракта, растворения осадка в буфере, инкубации пробы при 0 С в присутствии связывающего белка и меченого нуклеотида, фильтрования, отмывания несвязввшейся метки с последукацим рвдиометрическим измере. - . нием количества циклических нуклеотидов, о т л и ч а ю ш и й с я тем, что, с целью ускорения способа, инкубацию пробы проводят непосредственно на участке милипорового фильтра, покрытого гидрофобным материалом.