Способ количественного определения истинного белка в кормовых дрожжах

(19) 111 О 51) 4 6 01 М 33 САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ 4 й СР ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) Бейер Е. М. Некоторые данные оприменимости метода Лоури в зависимости от условий определения белка. - Лабораторное дело. 1976,10, с. 590 в 5.Соболева Г. А. и др. О способе определения истинного белка в дрожжах. - Гидролизная и лесотехническая промышленность, 1981, Я 7, с. 18 - 20.Емельянова И. 3. Химико-аналитическийконтроль гидролизных производств. М,: Лесная промышленность, 1976, с. 328,(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИСТИННОГО БЕЛКА В КОРМОВЫХ ДРОЖЖАХ(57) Изобретение относится к определению содержания истинного белка в кормовых дрожжах гидролизных производств или белково-витаминных производств или в белково-витаминных концентратах. Цель изобретения - повышение достоверности и сокращение времени. Способ заключается в том, что белок в кормовых дрожжах осаждают сульфатом меди в щелочной среде, отделяют осадок и растворяют при нагревании в щелочном растворе комплексона 111. К полученному раствору после разбавления его водой добавляют реактив Фолина и осуществляют фотоколориметрическое определение содержания белка в анализируемой пробе, используя в качестве стандарта раствор альбумина. 3 табл.Изобретение относится к исследованию и анализу материалов, в частности к определению содержания белка в кормовых дрожжах гидролизных производств или в белково-витаминных концентратах, и может быть использовано для автоматического контроля продукции гидролизно-дрожжевых заводов и заводов БВК микробиологической промышленности.Цель изобретения - повышение достоверности и сокращение времени определения,Способ заключается в том, что сначала отделяют белок от других компонентов путем осаждения его сульфатом меди в щелочной среде, а затем после отделения осадка его растворяют в щелочном растворе комплексона 111 при нагревании. Далее раствор разбавляют дистиллированной водой в 25 раз. К аликвотной части анализируемого раствора добавляют реактив Фолина с целью получения окрашенного комплекса (реакция Лоури). Полученный окрашенный раствор фотометрируют, используя светофильтр, пропускающий длины волн около 700 нм. Содержание белка рассчитывают с помощью предварительно построенного по стандартным растворам альбумина градуировочного графика или путем сравнительного измерения со стандартом.Продолжительность измерений по предлагаемому способу в 4 раза короче, чем по известному.Ускоренный перевод белка в раствор в предлагаемом способе достигается путем обработки осадка медно-белкового комплекса 0,25 М водным раствором комплексона 111 и последующим тридцатиминутным кипячении анализируемой смеси в 1 н. щелочи.Высокая селективность предлагаемого способа определения истинного белка связана прежде всего с использованием высокочувствительной и специфической реакции Лоури, а также с предварительным отделением значительной части мешающих примесей на стадии осаждения медно-белкового комплекса.В отличие от других: фотометрических реакций на белок, реакция Лоури настолько чувствительна, что позволяет повысить селективность метода путем разведения анализируемого раствора до предельных концентраций интерферирующих примесей. Предлагаемый способ определения белка в кормовых дрожжах осуществляют следующим образом.Приготавливают все необходимые реактивы и растворы.Реактив Фолина приготавливают по известным методикам (реактив Фолина можно хранить в темной закрытой склянке в течениегода). Перед использованием реактива Фолина устанавливают его нормальность путем титрования стандартным раствором щелочи, а затем разбавляют его дистилли 5 О 5 20 25 30 35 40 45 50 55 рованной водой до нормальности, равной единице (раствор Е).Раствор А приготавливают, растворяя 2 г углекислого натрия в 100 см 0,1 н. водного раствора едкого натра,Для приготовления раствора В сначала растворяют 10 г винно-кислого натрия-калия в 300 см дистиллированной воды. Добавляют туда 5 г сернокислой меди (Сц 504 5 Нг 0) и после растворения соли доводят объем до 1 л дистиллированной водой.Раствор С приготавливают, смешивая 49 см раствора А и 1 см раствора В. Обычно полученный раствор используют в течение суток,Указанные растворы используют для выполнения фотометрических определений как с исследуемым раствором белка, так и со стандартными растворами альбумина, приготовленными для построения градуировочного графика. Этот график зависимости оптической плотности окрашенного раствора (после проведения реакции Лоури) от содержания в нем альбумина строят всякий раз, когда заново приготавливается реактив Фолина. Следовательно, таким градуировочным графиком можно пользоваться в течение года.Непосредственно перед выполнением анализов готовят 2 Я-ный раствор СцЯО,х Х 5 НО; 2,5 ог-ный ин. растворы гидрооксида натрия, а также 0,25 М раствор комплексона 111. Эти растворы могут быть приготовлены заранее и использованы многократно.Способ осуществляют следующим образом.Берут точную навеску средней пробы дрожжей массой около 0,4 г, помещают ее в стакан вместимостью 200 см, добавляют 50 см доведенной до кипения дистиллированной воды, 10 см 12 О,-ного раствора сернокислой меди и по каплям при перемешивании 10 см 2,5 Я-ного раствора гидрооксида натрия. Полученному осадку дают отстояться и фильтруют его через бумажный фильтр. Осадок промывают двумя порциями (по 20 см) дистиллированной воды. Фильтрование и промывание осадка осуществляют дека нтацией, после чего фильтр с осадком возвращают в тот же стакан. К осадку добавляют при перемешивании 20 см 0,25 М раствора комплексона 111 и 60 см 1 н, раствора едкого натра. Содержимое стакана нагревают в течение 30 мин на кипящей водяной бане, периодически перемешивая раствор стеклянной палочкой, Затем раствор переносят в мерную колбу на 500 см , оставляя фильтр в стакане. При этом фильтр и стенки стакана промывают небольшими порциями горячей воды, сливая все промывные воды в мерную колбу с анализируемым раствором. Содержимое колбы охлаждают до комнатной1401380 Найдено истинного белка(средний результат сериианализов), % Контроли 15 руемоепредприятие 20 Астраханский ГДЗ 47,55 45,37 49,12 25 ВолжскийГЛЗ 30,71 30,20 30 КировскийБХЗ 34,04 Таблица 2 Взято, г ьбумин Найдено белка, г, по способу Ал 1 НК "НЕУЧА" предлагаемому Бернштейна 0,1459 0,1459 О О, 1458 (-О, 10%) О, 1437 (-1, 51%)0,0200 О, 1450 ( - 0,62%) О, 1516 (+3,91%) температуры под струей воды, раствор в колбе доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. 100 см полученного раствора переносят в мерную колбу на 250 см, доводят раствор до метки водой и перемешивают. С целью отделения взвешенных частиц из раствора берут около 20 см анализируемого вещества, фильтруют раствор в сухой стаканчик через фильтр с синей лентой, отбрасывая первую порцию фильтрата. Затем с помощью пипетки отбирают 5 см фильтрата, помещают его в мерную колбу на 25 см", добавляя туда 15 см раствора С и осторожно перемешивают в течение 10 мин. После этого добавляют 1,5 см раствора Е, доводят содержимое до метки дистиллированной водой и перемешивают, после чего оставляют стоять 30 мин. Полученный раствор синего цвета фотометрируют в кювете толщиной 1 см при длине волны Х,=690 нм на фотоколориметре, пользуясь красным светофильтром. В качестве нулевого раствора обычно используют раствор холостого опыта, который получают по описанной методике, заменив анализируемый раствор белка (5 см) соответствующим количеством дистиллированной воды. Оптическая плотность анализируемого раствора измеряется три раза. За истинный результат принимают среднее арифметическое трех параллельных измерений. По величине оптической плотности, пользуясь градуировочным графиком, рассчитывают количество белка в аликвотной части анализируемого (т, мкг), а затем массовую долю истинного белка в кормовых дрожжах по формуле, %: 0,025-,Оо)где у - количество белка в аликвотнойчасти раствора, найденное по градуировочному графику, мкг;0,025 - коэффициент, учитывающий разбавление, соотношение размерностей и т. д.;а масса анализируемой на вескидрожжей, г;ж - массовая доля влаги в кормовыхдрожжах, О.При необходимости получения более точных результатов анализа проводят одновременно анализ трех параллельных проб, а за истинный результат принимают среднее арифметическое результатов трех параллельных определений.Общая продолжительность измерения массовой доли истинного белка в кормовых дрожжах составляет 2 - 2,5 ч.В табл. 1 приведены в. качестве примера результаты определений содержания белка по предлагаемому способу в кормовых дрожжах гидролизно-дрожжевых заводов.Таблица 1 В табл. 2 дана сравнительная характеристика известного и предлагаемого способов измерения массовой доли белка в кормовых дрожжах.Для сравнения предлагаемого способа соспособом Бернштейна готовят модельные 40 смеси из белка и нуклеиновых кислот,Так как нет надежного способа выделения чистого белка из кормовых дрожжей, модельную смесь готовят из альбумина и ДНК, причем альбумин берут в количестве, отвечающем среднему содержанию белка в 45 навеске 0,4 г кормовых дрожжей, аДНК - 13 О от содержания альбумина. Результаты измерения белка приведены в табл, 1 (средние из 3-х определений)1401380 Таблица 3 Найдено белка, г, по способу Взято, г Нуклеиновыекислоты предлагаемому Бернштейна Альбумин 0,2089 (-1,187) 0,244 (+15,497.) 0,2114 0,0621 Формула изобретения Составитель Л. БорисоваРедактор А. Ворович Техред И. Верес Корректор А. Зи мо косовЗаказ 2535/43 Тираж 847 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 В состав кормовых дрожжей, кроме ДНК, могут входить и другие нуклеотиды. Для брльшего приближения модельных смесей к, составу кормовых дрожжей экстрагируют и них все компоненты, кроме белка, п тем обработки навески дрожжей 5 Я-ным р створом трихлоруксусной кислоты. Содерлание нуклеиновых кислот в экстракте определяют по методу Спирина, В полученТаким образом, при использовании предл гаемого способа осаждаемые солями меди н белковые азотсодержащие соединения (пук, еиновые кислоты) искажают результаты и, мерения истинного белка в кормовых дрожжах в пределах погрешности измерений, а по способу Бернштейна знач 11 тельно завышают результаты измерения и 1:тинного белка,Способ количественного определения ист нного белка в кормовых дрожжах, преном экстракте содержатся нуклеиновые кислоты в количестве 1,24 мг в см. Модельные смеси готовят из навески альбумина, к которой добавляют 50 смз экстракта из кормовых дрожжей. Раствор нейтрализуют до рН 7 и дадее операции проводят по предлагаемому способу и по способу Бернштейна, Результаты измерений (средние из 3-х определений) приведены в табл. 3. дусматривающий осаждение его сульфатом меди в щелочной среде, отделение осадка с последующей оценкой результатов, отличаюи 4 ийся тем, что, с целью повышения достоверности и сокращения времени определения, после отделения осадка осуществляют солюбилизацию белка путем выделения его в медно-белковый комплекс и разрушения его при нагревании в течение 30 мин на водяной бане в 0,25 М растворе комплексона 111 с последующим разбавлением раствора дистиллированной водой, а оценку результатов осуществляют спектрофотометрически,