Синтетический амфолит-носитель дляразделения биополимеров методомизоэлектрофокусирования и изотахофореза

Союз Советскмк Социалмстмческми Республик(22)Заявлено 30.05,79 (21) 2770103/23-05 (51)М. КЛ,с присоединением заявим Йо(23) ПриоритетС 08 С 73/02 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(54) СИНТЕТИЧЕСКИИ АМФОЛИТ-НОСИТЕЛЬДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ ВИОПОЛИМЕРОВМЕТОДОМ ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЯИ ИЗОТАХОФОРЕЗА 1Изобретение относится к получению амфолита-носителя для разделения и выделения различных биополимеров методами изоэлектрофокусирования и изотахофореза. 5Известно применение сшитого водо- растворимого полиэтиленполиамина (предпочтительно полиэтиленгексаамина. (ПЭГА), сшитого о(р-ненасыщенными кислотами, в частности акриловой 10 кислотой, в водной среде при соотношении аминогруппа: кислота, равном ,2:1 (реагент "амфолин"). Время синтеза при этом от 2 до б 0 ч, температу-.ра синтеза от 30 до 150 С (11 . 15К недостаткам известного технического решения относят наличие нежелательного минимума электропроводности и буферной емкости у сфокусированных амфолитов-носителей в области нейтральных рН (5-8); сложность предварительной ректификации ПЭГА (более 200 фС при 0,5 мм рт,ст, в атмосфере очищенного аргона); высокая себестоимость получаемых амфолитов-носителей 25Цель изобретения - увеличение буферной емкости и электропроводности амфолитов-носителей в нейтральной области рН, а также .расширения сырьевой базы. 2Цель достигается тем, что для разделения биополимеров методом изоэлектрофокусирования и изотахофореза ис- .пользуют водорастворимые полимеры наоснове низкокипящих полиэтиленполиаминов (ПЭПА), акриловой кислоты иМ,М-метиленбисакриламида, Низкокипящие ПЭПА, например дешевый и легкоочищаемый триэтилентетрамин (ТЭТА),имеют температуру кипения ниже 200 оС/(ТЭПА) ниже 270 С/10 мм рт.ст.За счет межмолекулярной сшивкиукаэанных ПЭПА при помощи М,М -метиленбисакриламида увеличивается молекулярный вес амфолита-носителя. В связи с увеличением числа аминогрупп вмолекуле уменьшается разница междуконстантами диссоциации этих групп иувеличивается число изомеров с изоэлектрическими точками в нейтральнойобласти рН, что ведет к увеличениюбуферной емкости и электропроводностиСпособ получения полимеров осуществляют следующим образом,К 25-ному водному раствору перегнанного под вакуумом (водоструйныйнасос) ТЭТА или ТЭПА при нагреваниии перемешивании добавляют М,М -метиленбисакриламида в мольном соотно802310 10 Формула изобретения Составитель А. ПереверзеваРедактор Л. Ушакова Техред М Лоя Корректор Н.Швыдкая Заказ 10503/29 Тираж 541 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, ЖРаушская наб., д. 4 5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 шенин 1:0,5. После центрифугирования при 5000 9 в течение 30 мин к центрифугату добавляют при охлаждении и перемешивании акриловую кислоту до мольного соотношения аминогруппа: кислота, равного 2:1. Смесь нагреваот при перемешйвании в течение 16- 20 ч при температуре 60-100 оС, Все операции проводят в атмосфере инертного газа, Цля снижения поглощения в ультрафиолетовой области спектра полученных продуктов последние могут быть обработаны активированным углем.Получаемый по предлагаемому способу амофлит-носитель может быть использован для разделения биополимеров с иэоэлектрическими точками, лежащими в интервале рН от 3,0 до 10,0 с высокой степенью разрешения.П р и м е р 1. В конической колбе, снабженной патрубками для ввода и вывода инертного газа н магнитнбй мешалкой, при нагревании растворяли 15,4 г К, Я-метиленбисакриламида в 116,8 г 25-ного водного раствора ТЭТА. После центрифугироьания и отделения осадка добавляли акриловую кислоту (до значения рН 7,8 в 1-ном водном растворе по отбираемым пробам ). В круглодонной колбе, снабженной мешалкой, обратным холодильником и патрубком для ввода аргона, проводили синтез в течение 20 ч при температуре 70 оС Полученный амфолитноситель пропускали при 50 оС через колонку емкостью 100 мл с влажным активированным углем и промывали колонку 100 мл дистиллированной воды. Продукт концентрировали на пленочном испарителе до 40-ной концентрации.Выход амфолита-носителя 79.П р и м е р 2. Процесс ведут аналогично гримеру 1, но порядок операций следующий. После добавления акриловой кислоты к раствору ТЭТА проводили синтез в течение 10 ч при 100 С, затем добавляли К, И -метиленбисакриламид, дополнительно нагревали с есь при перемешивании в течение 6 ч при 100 ОС. После центрифугирования и очистки активированным углем продукт упаривали до 40-ной концентрации.Выход амфолита-носителя 83.Амфолит-носитель, полученный по примеру 1, подвергали электрофокусированию на приборе К 8-2217 ИОТРНОЯ (Швеция). Определяли градиент рН и спектры разделения смесей белков.Параллельно проводили опыт с "амфолинами". По разделяющей способности амфолит-носитель, полученный по предлагаемому способу, не уступает импортным амфолитам-носителям.При титровании фракции амфолитовносителей, полученных при изоэлектрофокусировании в колонках с гелем Молселект Г(Венгрия, получены значения буферной емкости для известного амфолита и амфолита-носителя, полученного по предлагаемому способу. 15 Буферная емкость амфолита-носителиполученного по примеру 1, в 1,2-2,5раза выше в интервале рН 5-8, чембуферная емкость известного амфолита.Преимущества предлагаемого спосо- Щ ба получения амфолита-носителя слЕдующие: упрощается процесс и улучшается качество амфолита-носителя, снижается его стоимость по сравнению состоимостью ныне импортируемых реактивов, Например, цена амфолита-носителя фирмы "5 етча " (ФРГ) согласно рекламному проспекту на март 1977 г.колеблется в пределах 8500-21200 западногерманских марок в пересчете на1 кг 100-ного амфолита-носителя, це- ЗО на же исходных компонентов для синтеза амфолитов-носителей.по предлагаемому способу намного ниже: ТЭПА180 руб/кг, ТЭТА 80 руб/кг, акриловая кислота 30 руб/кг, й, Н -метилен бисакриламид 200 руб/кг. Следовательно, 1 кг 100-ного амфолита-носителя(без учета затрат на труд) составиториентировочно 70-100 руб/кг. Применение сшитых водорастворимыхаполимеров на основе низкокипящих полиэтиленполиаминов, акриловой кислоты и я,Н -метиленбисаариламида вкачестве синтетического амфолита-носителя для разделения. биополимеровметодом изоэлектрофокусирования ииэотахофореза.Источники информации,принятые ьо внимание при экспертизе1. Патент США Р 3485736, 260-75,опублик. 1969 прототип).