Способ количественного определения гидроперекисей липидов

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 060378 (21) 2588504/23-04с присоединением заявки Нов(51)М. Кл з С 01 й 27/46 Государственный комитет СССР но делан иэобретений и открытий(72) Авторы изобретения Л.И.Деев и А,В.Гурович Московский ордена Ленина и ордена Трудового КрасногоЗнамени государственный университет им, М,В.Ломоносова(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИДРОПЕРЕКИСЕЙ ЛИПИДОВИзобретение относится к областианалитической химии, а именно к способам количественного определенияперекисных соединений и может бытьприменено в биохимии, биофизике,микробиологии, органической химии.Известен способ количественногоопределения гидроперекисей липидовпутем обработки анализируемой пробы5-ным раствором соли Мора в 3-номрастворе соляной кислоты с последующим добавлением тиоцианата аммовияи колориметрированием полученногоокрашенного раствора (11,15Недостатком способа является низкая чувствительность определенияи ограниченная область применения(можно определять только водорастворимые гидроперекиси липидов);Наиболее близким к описываемомуизобретению по технической сущностии достигаемому результату являетсяспособ количественного определениягидрсперекисей липидов путем обработ ки анализируемой пробы смесью хлороформа и метанола, последовательнойобработкой раствором йодистого калияи 2-ным раствором уксусной кислотыи тиосульфатом натрия с последующим титрованием полученного растворараствором йодита калия 21.Недостатком способа является низкая чувствительность определенияоткрываемый минимум 10 т М при необходимом количестве липидов не менее5-20 мг, а также плохая избирательность (определению мешают любые дру-гие примеси перекисей органическихвеществ),Целью предлагаемого изобретенияявляется повышение чувствительностии избирательности определения.Поставленная цель достигаетсяописываемым способом количественногоопределения гидроперекисей липидов,заключающимся в обработке анализируемой пробы хлороформом и метаноломс последующим упариванием органического растворителя, растворениигидроперекнсей липидов в метанолеи добавленИи раствора сернокислогожелеза так, что".ы конечная концентрация гидроперекисей липидов в полученной смеси составляла 0,05-0,1 мг/мли измерении редокспотенциала смеси.Отличительным признаком способаявляется предварительное упариваниеорганического растворителя, раство775685 Формула изобретения аЕе 2 Составитель Л. СоломенцеваРедактор Л. Герасимова Техред М.Петко Корректор И. Муска Эакаэ 7736/60 Тираж 1019 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ЛПП "Патент", г.ужгород, ул, Проектная, 4 рение гидроперекисей липидов в метаноле и использование в качестве химического реагента раствора серно- кислого железа, которое добавляют так, чтобы конечная концентрация гидроперекисей липидов в полученной смеси составляла 0,05-0,1 мг/мл с последующим измерением редокспотенциала смеси.П р и м е р 1. 500 г печени гомогейизируют в 30 мл смеси Фолча (хлорофоРм " метанол = 2:1) в течениеО 10 мин, Раствор отфильтровывают и упаривают на роторном испарителе. По разнице веса отгоночной колбы,цо и после упаривания растворителя на аналитических весах определяют навес ку выделенных липидов 30 мг. Липицы растворяют в 60 мл 90-ного метанола.В измерительную ячейку наливают 9 мп 1 мм раствора Гебу 4 в 90-ном метаноле (рН 3,2) .Через 10 мин, ког О да устанавливается равновесное значение редокспотенциала, равное 367 мв, в ячейку вносят 1 мп исходного раствора липидов. Потенциал монотонно возрастает и через 10 мин устанавливается на новом постоянном уровне, равном 369 мв, По калибровочной кри вой рассчитывают изменение концентрации железа в ячейке, соответствующее изменению равновесного потенциала, и равном 2 нмоль, По формуле где С - концентрация липида в ячейке, мг/мл;ьГе - изменение концентрации железав растворе;ОООН 1 - концентрация гидроперекисейв нмоль/мг липида, рассчитывают количество гидроперекисей в исследуемом липидеОООН )= 2/20,5 = 20 нмоль/мглипида.П р и м е р 2. 500 мг печени гомогениэируют в 30 мл смеси Фолча в течение 10 мин. Раствор отфильтровывают и упаривают не роторном испарителе. По разнице веса отгоночной колбы до и после упаривания растворителя определяют навеску выделенных о липидов 35 мг, Липиды растворяют в 35 мг 90-ном метанола. В измерительную ячейку наливают9 мл 1 мМ раствора Ге 504 в 90%-номметаноле (рН 3,2),Через 10 мин устанавливается равновесное значение редокспотенциала, равное 367 мв. Вячейку добавляют 1 мл исходного раствора липидов. Через 10 мин устанавливается новое равновесное значениередокспотенциала, равное 370,5 мв.По калибровочной кривой рассчитываютизменение концентрации железа,соответствующее изменению равновесного редокспотенциала, и равное4 нмоль, По формуле определяют количество гидроперекисей в липидеяООН4/2 0,1 = 20 нмоль/мг липида,Предлагаемый способ позволяетопределить 0,5-1 мг гидроперекисилипида в определяемой пробе,открываемый минимум 10 М, определению не мешают перекиси других органических веществ. Способ количественного определения гидроперекисей липидов путем обработки анализируемой пробы органическим растворителем и химическим реагентом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности и избирательности определения, полученный раствор анализируемой пробы упаривают, остаток, содержащий гидроперекиси липидов, растворяют в метаноле и метанольный раствор обрабатывают раствором сернокислого железа, который добавляют так, чтобы конечная концентрация гидроперекисей липидов в полученной смеси составляла 0,05-0,1 мг/мл с последующим измерением редокспотенциала.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе1, Романова Л.А., Стальная И.Д, Метод определения гидроперекисей липидов с помощью тиоцианата аммония. Сборник "Современные методы в биохимии". Под ред. Ореховича В,Н. М., "Медицина", 1967, с. 62.2, Владимиров Ю,А Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М., "Наука", 1972, с. 238 (прототип).