Способ определения диоксиацетона и глицерина при их совместном присутствии в смеси

ОЛ ИСАЙКЕИЗОБРЕТЕН-ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Со 1 оз,СоветскнкСоцналнстнческнкРеспубпнк 1 и 900175Опублнковано 23.01,82. Бюллетень Рй 3 Дата овублнковання олнсаннв 23.0 1. 82(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИОКСИАЦЕТОНА И УЛИЦЕРИНД ПРИ ИХ СОВМЕСТНОМ ПРИСУТСТВИИ В СМЕСИ Изобретение относится к аналитической химии и касается способа раздельного количественного определения диоксиацетона и глицерина в их смесях в культуральных жидкостях, Смесь диоксиацетона и глицерина образуется при получении диоксиацетона микробиологическим путем. Диоксиацетон является важным продуктом для косметической проиышлен 1 О ности, например, в качестве основного компонента диоксиацетон входит в состав кремов для получения искусственного загара.15Известен способ, предназначенный для определения редуцирующих триоз, в тои числе диоксиацетона, а также гликолевого альдегида и аскорбиновой кислоты с пома 1 ью хлористого трифенилтетразолияи фотометрированием продукта взаиидействия, Глицерин определяют хроиатографированием культуральной жидкости на анионите последуоции использованием цветореагента и Фотометрирояанием 1,13 .Однако определению диоксиацетонамешают редуцируоцие вецества, в томчисле редуцирующие сахара, аскорбиновая кислота и др. Определениеглицерина является трудоемким про"цессои,Известен также анзиматическийспособ определения глицерина, диоксиацетона и глицеральдегида всмесях, заключающийся в обработкеанализируеиого раствора фериентамии фотометрированиеи продуктов реакции Р 3Недостатком способа является то,что ферментные реактивы дорогостояции дефицитны.Известен способ раздельного анялиза смеси глицерина с диоксиацето"нои путем комбинированного воздействия гипобромита и периодата калия.Согласно этому способу к одной части анализируемой пробы добавляют3 90017 раствор бромида калия, 5 мл 0,1 н. Н 04 и 15 мл 0,1 н, раствора бромата калия, через 10 мин добавляют.мл 1 н. раствора гидроокиси натрия и оставляют на 15 .мин. После этого добавляют 10 мл (3 и 25 мл 1 н. Н 501. Полученный раствор титруют 0,1 н. раствором тиосульфата натрия и расчитывают содержание глицерина в смеси, оДля определения диоксиацетона берут другую часть анализируемой пробы, добавляют к ней 15 мл 0,05 н. раствора периодата калия и выдерживают 24 ч. После этого к раство з ру добавляют 25-30 мл 03 серной кислоты, 2"3 капли хлорида рутения и 5-6 капель ферринового индикатора. Избыток периодата титруют 0,05 н. раствором соли мышьяковистой кисло ты и расчитывают общее содержание глицерина и диоксиацетона. Содержание последнего расчитывают по разности двух титрований 3) .Недостатками известного метода 2 являются сравнительно низкая чувствительность что не позволяет применять способ для анализа культуральных жидкостей с небольшим содержанием глицерина и диоксиацетона (010 мг/мл зо 0,1 мг/мл) и недостаточная тЬчность при анализе диоксиацетона - целевого продукта ферментации, что связано с косвенным определением,Цель изобретения - повышение чувсТ" вительности и точности определения. Поставленная цель достигается согласно способу определения диоксиацетона и глицерина при их совместном40 присутствии в смеси, заключающимся в том, что одну часть анализируемой пробы обрабатывают раствором дифениламина в смеси уксусной и серной кислот, взятых в объемном соотношении 1:0,11-0,15, с последующим фотомет 45 рированием, другую часть анализируемой пробы обрабатывают периодатом калия, последовательно добавляют смесь буферного раствора монохлоруксусной кислоты и 1-2 И раствора молибдата натрия с рН 2,9-3 и 0,5-0,7 Ираствора иодистого калия с последую щим фотометрированием.Чувствительность определения диоксиацетона увеличивается за счет того, что проводится прямое определение и взамен малочувствительномуреагенту - гипобромиту натрия 54,используется цветореагент - дифениламин, который в смеси кислот СН 4 СООН НЯОцв соотношении 1:0,11- 0,15 образует интенсивно окрашенный продукт с максимумом поглощения при 660 нм. Глицерин в среде смеси кислот с дифениламином не взаимодействует и определению диоксиацетона не мешает.Повышение чувствительности определения глицерина достигается тем, что добавлением 1-2 И молибдата натрия при рН 29-3 и иодида калия, после окисления периодатом образуется иод, шесть молекул которого пропорциональны одной молекуле глицерина. Таким образом, в 6 раз уменьшается определяемый минимум глицерина, Добавлением 1-2 М молибдата при ",рН 2,9-3,0 необходимо для связывания избытка 30 в комплекс, При больших или меньших указанных рН пределах комплекс разлагается и мешает определению. Меньшее количество молибдата недостаточно для связывания 7 0 в комплекс, а при более высоких - образуются нежелательные побочные продукты. Иодид калия при рН 29-30 взаимодействует с продуктом который образуется в результате окисления периодатом глицерина и диоксиацетона, Соответственно одному иону 30 выделяется 3 молекулы глицерина. Так как, из 1 молекулы глицерина образуется 2 иона 3 О,то одна молекула глицерина в конечном итоге соответствует б"ти молекулам 3 . Точность определения диоксиацетона достигается тем, что вместо косвенного анализа осуществляется прямое определение и при этом его точность мало влияет на погрешность определения глицерина.Точность определения глицерина несмотря на его косвенное определение, сохраняется, так как окисление пвриодатом осуществляют в 5"20 кратно разбавленном растворе по сравнению с тем, в котором определяется диоксиацетон, Вследствие этого в 2-10 раз снижается влияние погрешности определения диоксиацетона на определение глицерина.Способ осуществляется следующим образом.Разбавляют анализируемый раст" вор смеси диоксиацетона и глицерина до концентрации диоксиацетона50 55 5 9001 0,1-0,5 мг/мл раствор А). Разбавляют раствор А 5 - 20 кратно (,раствор Б). В растворе А определяют диоксиацетон. К раствору А прибавля" Ют дифениламиновый реактив, выдер" 5 живают 40 мин в кипящей водяной ба" не, после чего фотометриру 1 от при 660 нм водносантиметровых кварце" вых кюветах. Содержание диоксиацето" на находят по калибровочному графи ку, построенному по стандартным растворам диоксиацетона с концентрациями 0,05-0,50 мг/мл, Чувствительность анализа 0,05 мг, относительная ошибка +2,2.5В растворе Б определяют общее содержание диоксиацетона и глицерина следующим образом. К раствору Б прибавляют раствор периодата, выдерживают для окисления 2 ч, После 20 этого прибавляют смесь растворов с рН 2,9-3, состоящую из 1-2 М буферно- ного раствора монохлоруксусной кислоты с рН 2,9-3, 1-2 М раствора молибдата натрия в соотношении 1:0,25 25 и 0,5-0,7 И калия иодистого. Раствор фотометрируют при 352 нм. По калибровочному графику, построенному по. стандартным растворам К 30 с концентрациями 0,05-0,50 мг/50 мл, нахо- ЗО дят количество КЗО,соответствующее общему содержанию диоксиацетона и глицерина в смеси. Согласно известному содержанию диоксиацетона, определенному,дифениламиновым методем, расчитывают соответствующее количество КтОи по разнице с общим К 3 О находят соответствующее содержание глицерина в анализе.Чувствительность анализа 0,01 мг, относительная ошибка+3,53.Для анализа (в примерах 1-2) используют раствор смеси диоксиацетона и глицерина, содержащей диоксиацетона - 30,0 мг/мл, глицерина,5 мг/мл. В примерах 3-5 используют культуральные жидкости.1 П р и м е р 1. Соотношение ук" сусной и серной кислоты 1:0,11, концентрация раствора молибдата натрия 1 И, рН 2,9, концентрация раствора калия иодистого 0,5 М, 0,5 мл анализируемого раствора разбавляют до обьема 100 мл (200 кратно)(раствор А), 10 мл раствора А разбавляют до 100 мл (10 кратно) ( раствор Б),75 6 Готовят дифениламиновый реактивследующим образом.8 смесикислот, состоящей из54 мл ледяной уксусной кислоты и6 мл концентрированной серной кислоты, растворяет 0,6 г дифениламина.В химических пробирках к 0,5 мланализируемого раствора А прибавляют 4 мл дифениламинового реактива,выдерживают в кипящей водяной бане, охлаждает до комнатной температуры и измеряют оптическую плотность при 600 нм относительно холостого опыта, содержащего вместоанализа 0,5 мл дистиллированнойводы 0 =0,220, Соответственно покалибровочному графику находятконцентрацию диоксиацетона,С = 0,153 мг/мл. В анализируемомрастворе концентрация диоксиацетона30,60 мг/мл, в раство 0 153 100100 ре Б концентрация диоксиацетона 0 13.10" 0,0153 мг/мл.100Относительная ошибка анализа + 2,01 чувствительность 0,05 мг/мл.В растворе 6 определяют общее содержание диоксиацетона и глицерина, для чего в мерные колбы на 50 мл вносят 2 мл раствора Б, добавляет 2 мл 0,025 М раствора КЗО, доводят обьем до 20 мл дистиллированной водой и выдерживают 2 часа при комнатной температуре, После этого добавляет 10 мл смеси 1 М буферного раствора монохлоруксусной кислоты с рН 2,9 и 1 М раствора молибдата натрия, доведенной до рИ 2,9 и приготовленной в соотношении 1:0,625 После перемешивания в колбы вносят по 10 мл 0,5 М раствора калия иодистого, доводят дистиллированной водой .до метки мерных колб и измеряют оптическую плотность в односантиметровых кварцевых кюветах при 352 нм относительно холостого опыта 0= = 0,375. По калибровочному графику, построенному аналогично (с учетом вре мени окисления 15 мин), по стандарт ным растворам К 3 05 с концентрациями 0,05/0,50 мг/50 мл, находят соответствующую концентрацию С= 0,194 мг, 50 мл. Расчитывают концентрацию КЗО мг/50 мл, соответствующую содержанию диоксиацетона 0,0153 мг/мл в,2 мл раствора Б: 2,37 Ь 0,0153 20,0727 мг/мл, где 2,376 - количество ОО 1 соответствующее 1 мг диокси" ацетона, мг.По разнице с общей концентрацией 5 КУО находят количество КЭО,соответ" ствующее содержанию глицерйна в 2 мл раствора Б: 0,1940 - 0,0727 = 0,121 мгу 50 млСодержание глицерина в раство Р 6 Б О.ХЯ 0 121",одержание глицерина в анализи% 15 руемом раствореОь 010 100 1000,5 -1026,0 мг/мл,Относительная ошибка анализа1,96, чувствительность 0,01 мг/мл. лвП р и м е р 2. Соотношение уксус"ной и серной кислоты 1:0,13, концентрация раствора молибдата натрия 1,5 И,рН 3,0, концентрация раствора калияиодистого 0,6 И. иДифениламиновый реактив: в смесикислот, состоящей из 54 мл ледяной= 30,60 мг/мл.Относительная ошибка анализа 4 О 2,0, чувствительность 0,05 мгlмл.В растворе Б определяют общее содержание диоксиацетона и глицерина. (Ход анализа аналогичен примеру 1), При этом используют 1,5 И 45 молибдат натрия рН 3,0 концентрация калия иодистого 0,6 М.Найдено О = 0,370, С= г 0,189 мг КЗО/50 мл,Диоксиацетону соответствуют 2,376 0,0153 2 = 0,0727 мг кэ 05/50 млГлицерину соответствуют 0,1890- -0,0727 = 0,1163 мг КЗОТ/50 млСодержание глицерина в раствоБ 0,21 О, 63 0 О 25 мг/мл а 550 21 г О 1162в анализируемом растворе0 0125 100 10025,03 мг/мл0,51 О Относительная ошибка анализа 1 л 1,8 й, чувствительность 0,0 мг/мл,П р и м е р 3. Соотношение уксусной кислоты и серной 1 : 0,15, концентрация раствора молибдата натрия 2,0 И, рИ 3,1 концентрация раствора калия иодистого 0,7 И.Дифениламиновый реактив: в смеси кислот, состоящей из 54 мл ледяной уксусной кислоты и 8,2 мл концентрированной серной кислоты, растворяют 0,6 г дифениламина.Ход работы с расчетом аналогичен примеру 1.В растворе А определяют диоксиацетон. Найдено: О0,219 С= 0,152 мг/мл.В анализируемом растворе концентрация диоксиацетона0 12 1000,5+ 1,333, чувствительность 0,05 мг/мл. растворе Б определяют общее содержание глицерина и диоксиацетона. Найдено: О= 0,367, С == 24,90 мг/мл.Относительная ошибка анализа + 2,353, чувствительность 0,01 мlмл .П р и м е р 4. Определение содержания диоксиацетона и глицерина в культуральной жидкости в начальной стадии ферментации. Соотношение уксусной и серной кислоты 1.0,15, концентрация раствора молибдета натрия 1 М, рН 3,0, концентрация калия иодистого 0,7 М 1 мл исследуемой жидкости разбавляют до объема ОО йл (раствор А), 5 мл раствора А .разбавляют до 100 мл (раствор Б). Ход работы и расчетов аналогичен примеру.9 90В растворе А определяют диаксиацетон. Найдено 01 0,110, С = 0,076 мг/мл.В растворе анализируемой жидкости концентрация диоксиацетона 0 06 100-1 = 7,6 мг/мл, растворе Б 0175 1 О5 мл раствора А разбавляют до объема 25 мл (оаствор Б).В растворе А определяют диоксиацетон. Найдено 040,362, С 5 = 0,256 мг/мл.В анализируемом растворе концентрация диоксиацетона 02562000,5= 102,4 мг/мл, в растворе Б 0 256 2ф)5 0038 мг/млО"носительное стандартное отклонение определения диоксиацетона+ 2,2, чувствительность 0,05 мг/мл.В растворе Б определяют общеесодержание глицерина и диоксиацетона. В мерные колбы на 50 мл вносят 1 мл раствора Б, добавляют реактивы, как указано выше. НайденоО = 0,580, С = 0,321 кг КЗО /50 мл.Диоксиацетону соответствуют0,2376 0,0038 1 = 0,009 мг к 1 с/50 нлглицерину соответствуют 0,321-0,009 = 0,312 мг КЗО/50 мл,Содержание глицерина врастворе Б 0,215 0,312 = 0,067 мг/мл, ав исследуемой культуральной жидкдс"ти 0 06100 100134,0 мг/мл.Стандартное отклонение опредепения глицерина2,М, чувствительность 0,01 мг/мл.Р р и м е р 5. Определение содержания диоксиацетона и глицеринав культуральной жидкости в конечной стадии ферментации,Соотношение уксусной кислоты исерной - 1:0,11, концентрация раствора молибдата натрия - 2 М, рН 2,9,концентрация калия иодистого 0,6 Й.0,5 мл исследуемой жидкости разбавляют до объема 200 мл (раствор А). 0,051 мг/мл.Стандартное отклонение определениядиоксиацетона 2,23, чувствительность1 0,05 мг/мг,В растворе Б определяют общее содержание глицерина и диоксиацето"наВ мерные колбы на 50 мл вносят 1 2 ф 1 мл раствора Б, добавляют выше указанные растворы-реактивы, НайденоО= 0,425, С= 0,023 мг КЗОТ/50 мл,Дйоксиацетону соответствует 0,2376 хх 0,05 1 = 0,121 мг КЗО /50 мл, глицерину соответствует 0,223-0,121= 0,100 мг КЗОТ/50 мл. Содержание глицерина в растворе Б0,2150,1000,0215 мг/мл, в иссле-дуемой культуральной жидкости0 0215 200 2 5д .4- = 43 мг/мл.0,55 Стандартное отклонение определения глицерина + 3,53, чувствительность 0,01 мг/мл. данные сравнения предлагаемого способа с известным приведены в таб-.40 лице Чувствительность, мг/мл Точность +3 Способ,диоксиацетона глицерина 3,7 2,2 0,01 0,05 ПредлагаемыйИзвестный 0,14 4,5 2 7 до 40 0,40 В предлагаемом способе относительная ошибка определения диоксиацетона не превышает +2,23 при раз" личных соотношениях глицерина и Применение изобретения увеличивает чувствительность определения диоксиацетона в 3 раза, а чувствительность глицерина в 40 раз. диоксиацетона глицеринаФормула изобретения Составитель Л.РусановаТехред . А,Бабинец Корректор М.Коста Редактор НДжугант таи е ает и атити титаЗаказ 12173/6 1 Тираж 882 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССР.по делам изобретений и открытий113035,. Москва, Н, Раушская наб., д. 4/5ат а и Ч ттитиа и итти Филиал ППП ИПатент,г,ужгород, ул. Проектная, 4 диоксиацетона в смеси и не зависит от точности определения глицерина.Таким образом, предлагаемый способ позволяет осуществить анализ целевого и исходнОГО продукта установить их количественное соотношение в про цессе, например, ферментации, и на их основе регулировать производственный процесс, пронозировать выход целевого продукта, т.е. позволяет О управлять процессом Ферментации.Практическая значимость повышения чувствительности заключается в том, цто способом можно контролировать все стадии производства диоксиацетона, 15 включая культуральные жидкости, начиная с начальных стадий и до завершения процесса.Повышение точности определения диоксиацетона позволяет более надежно предвидеть ожидаемый выход целевого продукта, улучшить качество диоксиацетона и усовершенствовать техно" логию производства в целом. Способ определения диоксиацетона и глицерина при их совместном при 0 сутствии в смеси, включающий раздельную обработку анализируемойпробы и использование периодата калия,5 12о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения чувствительностии точности ойределения, одну частьанализируемой пробы обрабатываютраствором дифениламина в смеси ук"сусной и серной кислот, взятых вобъемном соотношении 1:0,11-0,15с последующим фотометрированием,другую часть анализируемой пробыобрабатывают периодатом калия,последовательно добавляют смесьбуферного раствора монохлоруксуснойкислоты и 1-2 М раствора молибда"та натрия с рН = 2,93 и 0,5-0, Мраствора иодистого калия с последующим Фотометрированием.Источники информации,1принятые во внимание при экспертизе1. Плакунова В.Г. Методики количественного определения триоз и глицерина в культурах микроорганизмов.- "Микробиология", т. 31, вып. 6,с, 1094 1098,2. Г, К. Р 1 пйег. Епгупц.с Аззау ОГС 1 усего 1, РЖуйгохуасеопе апйС 1 усега 1 йейуйе, - "АгсЬЫез ОГ ВюсЬеппз 1 гу апс 1 В 3.орЫ.зус", 19 б 7, 121,р. 404414.3. Р.С. дьеппа Езййпай 1 оп оГ Р 1 усего 1 апй й 1 пуйгоху исе 1 опе (ййпег)3 п 1 Ьег впхйцгея. -"Чцпапа Раййай апцзапсйап Ра 1:гЖа", 1971, 14,М 1, р. 13-15 (прототип).