Способ получения глюкуронидазы

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоц 1 ивлистическихРеспублик(53) УДК 615.45: :615.7 (088.8) во лоном изобретений н отярытнй(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ф-ГЛЮКУРОНИДАЗЫ Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно кспособам получения ферментных препаратов,используемых в биохимических и медицинских исследованиях.Известен способ получения д-глюкуронидазы из экстракта измельченной печенифракционированием в ацетатном буферерН 5,0, аутолизом при 38 С в течение 8 -10 ч, отделением осадка центрифугированием,обработкой ацетатным буфером, добавлениемсульфата аммония и выделением целевого 10продукта в смеси ацетон-вода в соотношении1:2 1,Однако известный способ не обеспечиваетполучения препарата с высокой активностью(активность препарата 100000 - 120000 ед/г).15Целью изобретения является повышениеактивности препарата.Это достигается тем, что по предлагаемому способу экстракт обрабатывают водой,центрифугируют, осадок обрабатывают водой, раствор диализуют и лиофилизируют. 20Пример 1. Свежую печень измельчаютна мясорубке. В реактор с мешалкой загружают 10 кг фарша и смешивают с 7,5 литрами 0,2 М ацетатного буфера рН 5,0. Смесь 2выливают в кастрюлю и выдерживают 20 чв термостате при 37 С. Осадок отделяютцентрифуги рованием на М 1 з 1 га при2500 об/мин в течение 30 мин при 15 - 20 С.Фермент содержится в центрифугате. Осадокпромывают 3,5 л 0,2 М ацетатного буферарН 5,0, снова центрифугируют при 2500 об/мин,30 мин при 15 - 20 С. Экстракты соединяют,Общий объем центрифугата около 18 литров.Осадок выбрасывают.К 18 л экстракта при перемешиваниидобавляют 6 кг сухого сульфата аммонияиз расчета 0,334 кг на 1 л экстракта при15 - 20 С Перемешивание продолжают еще30 мин до полного растворения сульфатааммония. Раствор выдерживают 12 ч при0 - 4 С без перемешивания. Выпавший осадок отделяют центрифуги ров анием при2500 об/мин 30 мин, тепмпература 0 - 4 С.Центрифугат отбрасывают. Осадок промывают 5 л 23,2%-ного раствора сернокислогоаммония, охлажденного до 0 - 4 С и центрифугируют при 2500 об/мин в течение 30 минпри О - 4 С,Промытый осадок растворяют в 2 л деминерализованной воды и для лучшего растворения суспензкю выдерживают в термо733685 Формула изобретения Составитель С. МалютинаТехред К. Шуфрич Корректор М. Вигула Тираж 673 Подписное Редактор Л. Батанова Заказ 1939/8 ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патент г. Ужгород, ул, Проектная, 4стате при 37 С 2 ч. Нерастворившиеся примеси отделяют центрифугированием при2500 об/мин в течение 40 мин при 10 - 20 С,К раствору д-глюкуронидазы около 2,2 лпри постоянном перемешивании прибавляют1 кг (350 г/л) сульфата аммония и оставляют на 12 ч при 0 - 4 С. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при2500 об/мин и 4 С в течение 40 мин. Фильтрат отбрасывают. Осадок растворяют в 1 лводы и центрифугируют. Центрифугат диализуют в течение 4 сут и лиофильно высушивают. Выделенный препарат имеет активность 312000 е/г.Выход - 60 г.Осадок после последнего центрифугирования растворяют в 0,5 л воды и отделяютпримеси центрифугированием. Центрифугатдиализуют в течение 2 сут и лиофильновысушивают.Активность - 192000 е/г.Выход - 30 г,Пример 2, 8 кг печени гомогенизируютс 6 л 0,2 М ацетатного буфера рН 5,0 игомогенат оставляют на автолиз в течение20 ч при 37 С. Автолизат центрифугируют.Осадок промывают ацетатным буферомрН 5,0 и центрифугируют. Центрифугатыобъединяют 16 л.К 16 л экстракта прибавляют сульфатаммония из расчета 0,334 кг на 1 а экстрактаи через 12 ч выпавший осадок отделяютцентрифугированием. Осадок промывают4 л 23,2%-ного раствора сернокислого аммония и центрифугируют, Центрифугаты отбрасывают.Осадок, содержащий фермент ф-глюкуронидазы, растворяют в 0,9 л дистиллированной воды и центрифугируют. Центрифугати осадок обрабатывают отдельно. Водный раствор диализуют в течение 5 сут и лиофильно высушивают. Активность выделенного препарата 320000 е/г.Выход - 50 г.Осадок после центрифугирования раст воряют в 0,7 л воды и центрифугируют.Полученный раствор диализуют и лиофильно высушивают.Активность выделенного препарата100000 е/г.Выход 30 г.1 п Предлагаемый способ обеспечивает улучшение качества ферментного препарата /З-глюкуронидазы, который широко используется в медицинских и биохимических исследованиях, Очистка препарата от примесей предотвращает инактивацию и обеспечивает повышение активности и чистоты ф-глюкуронидазы в 3 - 5 раз. Использование такого препарата не требует присутствия активатора - ДНК. Исключение ацетона создает безопасность условия труда,20 Способ получения ф-глюкуронидазы путем экстрагирования измельченной печени,выдерживания в ацетатном буфере, отделения осадка, обработки его ацетатным буфером и высаливания сернокислым аммонием,отличающийся тем, что, с целью повышенияактивности, экстракт обрабатывают водой,зп центрифугируют, осадок обрабатывают водой, раствор диализуют и лиофилизируют.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Крехова М. А. Проблемы эндокринологии и гормонотерапии. 1960, т. 6, Ма 2,с. 55 - 63.