Способ получения противореагинового иммуноглобулина

7 Союз Советски кСоциалистическикРеспублик ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(51) М. Кл,А 61 К 39/00 Государственный комитет ао делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Институт зоологии и паразитологии АН Литовской ССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОРЕАГИНОВОГО ИММУНОГЛОБУЛ ИНАИзобретение относится к области медицины, а именно иммунологии.Известен способ получения противореагинового иммуноглобулина путем иммунизации животных, с последуюгцим отделением сыворотки крови, ее очисткой и выделением целевого продукта 1.Однако известный способ является трудоемким.Целью изобретения является упрощение способа.Эта цель достигается тем, что животных иммунизируют суммарной фракцией лимфоцитов, выделенных из миндалин, аденоидов, бронхиальных или мезентериальных лимфатических узлов, а очистку ведут с помощью иммуносорбции суспензией Т-лимфоцитов и сывороточными глобулинами типов б, А, М, Д.Пример. Приготовление суммарной лимфоцитарной фракции.Лимфоциты получают из брыжечных лимфоузлов кроликов. Лимфоузлы извлекают, обезжиривают и помещают в предварительно охлажденный раствор Хенкса. Лимфоциты из собранных лимфоузлов выделяли по методике А. Адаз 1 огп, Лимфоузлы окончательно очищают от жировых и соединительных тканей и измельчают ножницами до пастообразной консистенции в холодной камере при температуре до+4 С. Измельченную массу заливают двумя объемами раствора Хенкса и во избежание поврежде-.ния клеток, вместо гомогенизатора встряхивают в колбе 5 мин, Полученную массу фильтруют через двойной слой капроновой ткани. Полученный фильтрат центрифугируют в течение 15 мин в рефрижераторной 10 центрифуге при + 4 С и при 1000 об/мин,так как 2500 об/мин вызывает слипание клеток. Надосадочную жидкость сливают, а из полученных лимфоцитов делают по четыре мазка для контроля.20 мл клеток смешивают с 30 мл ЬМЕРи добавляют к полученной взвеси 140 мл 95%-ного глицерина для микроскопии с 0,003 мл насыщенного раствора хлористого магния (МдС 1 в 0,005 М). ЬМЕР готовили путем растворения при нагревании 1,488 г 20 0,004 М ЭДТА в 65 мл 0,00 М раствораоднозамещенного фосфата натрии (1 х)аН аРО,), добавляя сахарозы 0,24 М 82,152 г и 1000 мл дистиллированной воды. Все растворы употребляют в охлажденном до 4 С виде. Таким733686 Формула изобретения 3способом подготовленная смесь лимфоцитовхранилась до иммунизации при - 20 С.Перед иммунизацией лошади с 1 МЕР иглицерин трижды смывают физиологическимраствором и центрифугируют.Противореагиновую антисыворотку(ПРС) получают путем иммунизации лошади. Лошадь иммунизируют 1, 3, 6-й день30 мл взвеси лимфоцитов (что составляет4 109 клеток) с 30 мл адьюванта Фрейнде,На 8, 9, 13, 23 и 25-й день лошадь иммунизируют тем же количеством клеток на физио ологическом растворе, но без адьюванта. На10-й день после последней иммунизации лошадь обескровливают в стерильные цилиндры на 1000 мл. С целью увеличения ретракции сгустка применяют специальные гири.Полученную антилимфоцитарную сыворотку13(АЛС) инактивируют при 56 С 30 мин.Очистку полученной антисыворотки проводят с помощью иммуноадсорбции антисыворотки Т-лимфоцитами,Удаление из антисыворотки антител кдругим классам иммуноглобулинов осуществляют с помощью глюторальдегидного иммуносорбента,Выделение противореагинового антитела(ПРГ) осуществляют из ПРС спиртовымметодом. Все процессы выделения глобули анов проводят в условиях, близких к стерильности, в сосудах из нержавеющей стали,в камерах при температуре ниже 0 С, медленно добавляя этиловый спирт в АЛС до26% при рН 6,8 - 7,2 и температуре - 10 С,выпадает в виде осадка фракция гаммаглобулинов с примесью. Осадок растворяютдистиллированной водой и добавляют спиртдо концентрации 13% при рН 5,1 и температуре от - 5 до - 6 С. В осадок выпадаютбета-глобулины и небольшое количество зтальбумина, альфа-глобулина и гамма-глобулина. В растворе остается очищенныйгамма-глобулин, Добавляют спирт до кон 4центрации 26 О/, при рН 7 - 7,2 и температуре - 10 С, в осадок выпадают очищенный гамма-глобулин. С целью удаления спирта проводят лиофилизацию.Из сухой субстанции готовят 5%-ный раствор ПРГ. В качестве растворителя применяют физиологический раствор. Изготовленные растворы подвергают стерилизирующей фильтрации и биологическому, а также химическому контролю (стерильность, апирогенность, безвредность, содержание белка, электрофоретическая однородность) по требованию регламента производства человеческого гамма-глобулина.Предлагаемый способ позволяет получить эффективную противореагиновую анти- сыворотку в больших количествах, используя в качестве источника антигена легко доступные источники (гланды, аденоиды, мезентиральные лимфоузлы), и не требует для получения антисыворотки предварительного фракционирования и очистки, является менее трудоемким,Способ получечия противореагиновогоиммуноглобулина путем иммунизации животных, с последующим отделением сыворотки крови, ее очисткой и выделением целевогопродукта, отличающийся тем, что, с цельюупрощения способа, животных иммунизируют суммарной фракцией лимфоцитов, выделенных из миндалин, аденоидов, бронхиальных или мезентериальных лимфатическихузлов, а очистку ведут с помощью иммуносорбции суспензией Т-лимфоцитов и сывороточными глобулинами типов б, А, М, Д,Источники информации,принятье во внимание при экспертизе1. 11 гпгпцпо 1 оду, 13,1967, р. 38.Редактор Е. Хорив а Заказ 1939/8 Составитель С. /11 алотина Техред К. Шуфрнч Корректор М. Внгула Тираж 673 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4