Способ определения амидазной активности биологических материалов

О П И С А Н И Е пц зувИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик К АВТОРСКОМУ СВИДИТНоЬСТВУО с присоединением заявке г(о -риоритет Государстооннмй ноиототСооото Инннстроо СССРоо делам нзооротоннйн открытнй(43) Опубликовано О 5.12.783 юллетень Ио 45 (45) йата опубликования описаиия 10.12,78,А. Г. Матарламов, А. А. Заикин(72) Авторы изобретени иевс научно-исследовательский инсередвваная крови(54 ОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИДАЗНОЙ АК БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ тение относится к технике опреидазиой активности преимущестаминазы и аспарагнназы бнолоатериалов и может быть испольеднцине, например в клинической ри диагностике и прогнозироваокрашивая ым раствор я и гипохл биологических материалоществляют водно-ацетониола, нитропруссита нагкалия, после чего смесьтемпературе 3 - 38 С в5 а колориметрированне пволны б 30 - 640 нм.Способ осуществляюзом. Изобрделенияенно глическнховано врактикеии. м ор выдерживают при чение 30 - 40 мин, оводят при длине едующи Известен способ определения амндазной активности биологических материалов, предусматривающий приготовление смеси, содержащей исходный материал, субстрат н буфер, иикубирование ее, введение химреагентов для окрашивания с последующим колориметрированием полученной смеси и определением активного по величине экстинкции 111.Этот способ наиболее близок к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату.Недостатком способа является то, что он не обеспечивает высокой чувствительности (1 - 2 мкг азота аммиака), процесс определения сложен, трудоемок и длителен.Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение определения.Это достигается тем, что в предлагаемом способе определения амидазиой активности К 0,2 мл бноматернала прибавляют 0,2 мл0,5 Ы фосфатного буфера с рН 7,9 - 8,5 и 10 0,1 мл свежеприготовленного О,5 М раствора субстрата (глутамина или аспарагина), доводят общий объем инкубационной смеси до 1 мл бидистиллированной водой и инкубируют 15 - 30 мин прн 37 - 38 С, После тоокончания ннкубацин добавляют 2,5 мл реактива А, содержащегофенол (кристаллический) г 25ацетон, мл 250 ннтропруссит натрия, г 0,05 воду (бидйстиллироваи 20 ную), мл 250, тщательно перемешивают и добавляют 2,5 мл реактива Б, содержащего 1% (по активному.хлору) гипохлорида калия, повторно тщательно перемешивают и инкубируют 30 -636258 Формула изобретения Составитель А. Бражникова Редактор Н. Ахмедова ТехредО. Луговая Корректор Д, Мельниченко Заказ 6884/20 Тираж 526 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по дедам нзббретений и от к рыл нй13035, Москва, Ж, Раугиская наб., д. 45 Филиал ППП Патеитэ, г. Ужгород, ул. Проектная, 440 мин при 37 С до появления синей окраски, 11 осле чего прозрачный синий раствор колориметрируют против контроля при дли-. не волны 630 - 640 им.В контроле биоматериал прибавляют в инкубационную смесь после добавления реактива А.Активность фермента (аспарагиназы и глутаминазы) определяют по стандартной калибровочной кривой в пересчете на коли,чество азота аммиака, образовавшегося в результате ферментативного расщеплении субстрата.11 остроение стандартной калибровочной кривой для определения амидазной активности биоматериалов осуществляют следующим образом. К 0,2 мл 0,5 М фосфатного буфера с рН 7,9 - 8,5 прибавляют 0,1 мл светкеприготовлениого 0,15 М раствора субстрата (глутамина или аспарагина) и 0,5 мл раствора сернокислого аммония, содержащего в этом объеме 0,2 - 10,0 мкг азота, К смеси добавлгиот реактив А, биоматериал и реактив Б. Колориметрирование окрашенного раствора проводят вышеописанным способом.ПримерОпределение глутаминазной активности ткани мозга.К О,2 мл 0,5/о гомогената ткани мозга прибавляют 0,5 мл 0,5 М фосфатного буфера с рН 8,1 и 0,3 мл свежеприготовленного 0,05 Я раствора субстрата - глутамина и инкубируют в течение 15 мин при 37 С. После окончания иикубации к смеси добавлгиот 2,5 мл водно-ацетонового раствора фенола и иитропруссита натрия, тщательно перемешивавт и добавляют 2,5 мл раствора гипохлорида калия, повторно тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37"С, после чего иолориметрнруют против контроля при длине волны 630 нм.Пример 2.Определение глутамипазной активности ткани почек,К 0,2 мл 0,2 й гомогената ткани почек прибавляют 0,5 мл 0,5 М оосфатного буфера с рК 8,2 и О,Змл свежеприготовленного 0,05 М раствора субстрата - . глутамнна и инкубируют в течение 20 мин при 37 С, После окончания пи 1 субации окращивание и колориметрирование окрашенного раствора проводят, как описано в примере 1.Пример 3.Определение глутаминазиой активности ткани печени.К 0,2 мл 2 отв гомогената ткани печени прибавляют 0,2 мл 0,5 М фосфатного буфера с рН 7,9 и 0,1 мл свежеприготовленного 0,15 М раствора субстрата - глутамина, доводят общий объем инкубационнойсмеси до 1 мл бидистиллированной водой5 и инкубируют 15 мин при 37 С. После окончания инкубации окрашивание и колориметрирование окрашенного раствора проводят, как описано в примере .Пример 4,Определение аспарагиназной активноститкани печени.К 0,2 мл 2 о/в гомогената ткани печениприбавляют 0,2 мл 0,5 М фосфатного буфера с рН 8,5 и 0,1 мл свежеприготовленного0,15 М раствора субстрата - аспарагина,15 доводят общий объем инкубационной смесидо 1 мл бидистиллированной водой и инкубируют 15 мин при 37 С. После окончанияинкубации окрашивание и колориметрирование окрашенных растворов проводят, какописано в примере 1,20 Предлагаемый способ определения амидазной активности биологических материалов может найти широкое применение приполучении биопрепаратов для лечения лейкозов и опухолевых заболеваний, .так какпозволяет по сравнению с известным способом упростить определение чистоты получаемых препаратов, их биологическую активность, а также удешевляет и упрощает методы контроля качества биопрепаратов навсех этапах их получения.ЗО Способ определения амидазной активности биологических материалов, предусматривающий .приготовление смеси, содержащей 35 исходный материал, субстрат н буфер, инкубирование ее, введение химреагентов для окрашивания с последующим колориметрированием полученной смеси и определением активности по величине экстинкции, отличаюи 1 ийся тем, что, с цельв повышения чувствительности и упрощения определения, окрашивание осуществляют водно-ацетоновым раствором фенола, нитропруссита натрия и гипохлоридом калия, после чего смесь выдерживают при температуре 37 - 38 С в 451 ечение 30 - 40 мин., а колориметрирование проводят при длине волны 630 в 6 нм,Источники информации, принятые во внимание нри экспертизе:1, Силакова А. И. и др. Микрометодопределения аммиака и глутамина в ткане О вых трихлоруксусных экстрактах, - Вопросы медицинской химинъ, М 1962, т.И 1, в. 5, с. 538 - 546.