Способ выделения -аспарагиназы

(23) ПриоритетОпубликовано 30.03.7Дата опубликования ооударствеииыи комит Совета Министров ССС по делам изобретеиийи открытий Бюллетень Ме 12(72) Авторы изобретения Р, А. Жагат, Г, И. Клейнер, Д, Я. Дайя, Л, В. Поярковаи В, Я. Штамердена Трудового Красного Знамени институт органическогосинтеза АН Латвийской ССР(71) Заявитель О 4) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ 1.-АСПАРАГИНАЗЫ Изобретение относится к способам получения фермента 1.-аспарагиназы, используемого в медицине для лечения злокачественных новообразований, особенно лейкозов, а именно к способам выделения этого фермента из клеток микроорганизмов.Известны различные способы выделения 1.- аспарагиназы из клеток микроорганизмов, например Езс)ег 1 сЫа со 11. Так, в частности, известен способ, предусматривающий обработку биомассы микроорганизма ацетоном, сушку и извлечение фермента из сухого ацетонового порошка водой. Полученный экстракт подкисляют до рН 4,0 - 4,5 и выпавший осадок примесей отделяют, например, центрифугированием. После этого к раствору фермента добавляют сульфат аммония до насыщения 40 - 50%, подвергают термической обработке при 55 С и выпавший осадок примесей отделяют, например, фильгрованием или центрифугированием. К раствору фермента добавляют сульфат аммония почти до полного насыщения, выпавший осадок фермента отделяют центрифугированием, растворяют в буфере. Получают раствор фермента с активностью 26 МЕ/мг и выходом 75%.Таким образом, получение ацетонового порошка биомассы связано с применением значительного количества огневзрывоопасного пастворителя - ацетона. Обработка биомассы ацетоном и сушка ее в промышленных масштабах - процесс опасный, вредный и неэкономичный, Процесс выделения фермента трудоемок, а эффективность его,незначитель на. Известный способ неэкономичен.Применение сульфата аммония для фракционирования фермента из слабых растворов также нежелательно, так как требует значительного расхода реагента, который затем не 0 регенерируется. Сбрасывание такого отхода вводоемы запрещено.Цель изобретения - повысить чистоту ивыход фермента. 15 Для этого в качестве органического растворителя используют изопропиловый спирт и обработку биомассы ведут при соотношении компонентов от 1: 4 до 1: 8 при 0 - 20 С, в качестве стабилизатора используют аспарагино 2 д вую кислоту в концентрации 0,005 -0,015 моль/л, а после удаления осадка балластных белков раствор концентрируют в вакууме при 20 - 25 С и осаждение 1.-аспарагпназы осуществляют из концентрированного 25 раствора добавлением безводного изопропилового спирта в количестве 1,0 - 2,0 объема на количество раствора.Фермент, получающийся по предлагаемомуспособу, содержит до 120 МЕ/мг белка, что 30 значительно упрощает получение лекарственСоставитель Н. Андреева Техред А, Овчинникова Корректор О. Тюрина Редактор М. Дмитриева Заказ 9037 Изд. Мв 326 Тпрагк 589 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4 5Типография, пр. Сапунова, 2 ной формы, а выход от исходной биомассы превышает 50%.Предлагаемый способ состоит в следующем.Биомассу микроорганизма обрабатывают изопропиловым спиртом в соотношении от 1: 4 до 1: 8, растворнтель отделяют, например, центрифугированием, фермент извлекают водой. Ввиду присутствия в растворителе изопропилового спирта значйтельная часть белков и других примесей остается в осадке. Для дальнейшей очистки экстракт подкисляют уксусной кислотой до рН 4,5 - 5,0, инкубируют при 50 С, добавив для стабилизации аспарагиновую кислоту в концентрации 0,005 - 0,015 моль/л, и, отделив неактивный осадок, например, центрифугированием, концентрируют раствор в вакууме, после чего осаждают активную фракцию 1 - 2 объемами изопропилового спирта. Изопропиловый спирт, отделяемый после обработки биомассы н из маточника после осаждения фермента, может быть регенерирован ректификацией и повторно использован в производстве.П р и м е р. 15,6 кг бактериальной массы, полученной сепарированием культуральной жидкости Езсйег 1 сЫа со 11 на сепараторе с влажностью 85/о, содержащей 810 МЕ аспарагиназы в 1 г сухого вещества (всего 1,8710 в МЕ при удельной активности 1,2 МЕ/мг белка), загрузили в аппарат с мешалкой и при 10 С обработали 90 л изопропилового спирта. После отделения растворителя на суперцентрифуге получили 7,1 кг биомассы, содержащей 28,3% сухого вещества, 52,7 оизопропилового спирта и 250 МЕ/г биомассы. Выход 95,0% от содержания фермента в биомассе.Спиртовую биомассу, содержащую 28,3 сухого вещества, загрузили в аппарат с мешалкой и обработали 40 л дистиллированной воды при комнатной температуре. )Кидкость отделили от осадка на шестикамерном сепараторе. Получили 39,7 л водно-спиртового экстракта, содержащего 40 МЕ фермента в мл. Удельная активность 7,0 МЕ/мг белка. Выход 85,0/о от содеряания фермента в биомассе.Экстракт загрузили в аппарат с мешалкой, добавили 52,8 г аспарагиновой кислоты, под 5 1.) 15 2,) 25 30 35 40 45 50 кислили раствор 2 М раствором, уксусной кислоты до рН 4,7, нагрели до 50 С, выдержали при этой температуре в течение 30 мнп, охладили жидкость до 7 С и выдержали в течение 30 мин. Осадок отделили от жидкости с помощью суперцентрифуги, и довели рН раствора до 5,5 - 5,0 1 М раствором СаОН. Получили 38,8 л раствора, содержащего 37 МЕ/мл, удельная активность 23 МЕ/мг белка. Выход 76,5 оот содержания фермента в биомассе.Ферментный раствор упарили на циркуляционной вакуум-выпарной установке при остаточном давлении 25 - 30 мм рт. ст. и температуре в парах 25 - 30 С до 11,9 л.Концентрат загрузили в аппарат с мешалкой, добавили при 20 С 17,7 л изопропилового спирта, выпавший осадок отделили от жидкости на трубчатой суперцентрифуге и растворили в 500 мл дистиллированной воды. Получили раствор аспарагиназы, содержащий 2300 МЕ/мл с удельной активностью 110 МЕ/мг белка, Выход 61,5 от содср)кания фермента в исходной биомассе.Формула изобретенияСпособ выделения 1.-аспарагиназы из биомассы микроорганизма, например Езс 1)ег 1 сЫа со 11, предусматривающий обработку биомассы органическим растворителем, экстракцию образующегося осадка водой, подкисление экстракта, например уксусной кислотой, добавление к нему стабилизатора 1.-аспарагиназы, нагревание полученного раствора, удаление выпавшего осадка балластных белков и осаждение из раствора 1.-аспарагиназы, отл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чистоты и выхода фермента, в качестве органического растворителя используют изопропиловый спирт и обработку биомассы ведут при соотношении компонентов от 1: 4 до 1: 8 при 0 - 20 С, в качестве стабилизатора используют аспарагиновую кислоту в концентрации 0,005 - 0,015 моль/л, а после удаления осадка балластных белков раствор концентрируют в вакууме при 20 - 25 С и осаждение 1.- аспарагиназы осуществляют из концентрированного раствора добавлением безводного изопропилового спирта в количестве 1,0 - 2,0 объема на количество раствора,