Способ получения 6-оксиметил-2-нафтойной кислоты

(51) М, Кл. С 124 13/00 соединением заявкиГосударственный комите Совета Министров ССС ло делам изобретенийи открытий(О 88,8) Опубликовано 15.03,75. Бюллетень10 Дата опубликован писания 26.09.7 И. И, Старовойтов, С. Ю. Пширков Г, И. Яковлев и В М. Аданиниохимии и физиологии микроорганиз ова,(71) Заявител АН СССР нстит 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 6 ОКСИМЕТИЛ-НАФТОЙ КИСЛОТЫобиологиче получени помо ь к мик менно ислоть Изобретение относится Рской промышленности, а и к ю 6-оксиметил-нафтойной к т с щ ю микроорганизмов.Известен способ получения 6-оксиметил- нафтойной кислоты путем окисления 2,6-диметилнафталина.В известном способе 6-оксиметил-нафтойную кислоту получают химическим путем прямым окислением кислородом 2,6-диметилнафталина при 200 С под избыточным давлением и титановом реакторе в присутствии таких катализаторов, как окись азота и селен.Недостатками этого способа являются жесткие условия процесса (высокая температура, давление), использование дорогостоящих материалов для аппаратуры (титановый реактор) и низкий выход 6-оксиметил-нафтойной кислоты.С целью упрощения процесса и повышения выхода продукта по предлагаемому способу проводят окисление 2,6-диметилнафталина с помощью микроорганизмов из рода Рзецдогпопаз, выращенных на минерально-солевой среде, содержащей источники углерода в виде ароматических соединений.Из рода Рзецг 1 огпопаз используют вид рцг 1- Йа штамм 7.Окисление 2,6-диме н до 6-оксиметил-нафтойной ки т ает однотилнафтали слоты про а ек(72) Авторы изобретения Г, К, Скряб стадийно как в опытах с растущими культурами бактерий, так и при использовании отмытых (покоящихся) клеток микроорганизмов, предварительно выращенных на мине 5 ральных средах, содержащих источники углерода, азота и микроэлементы.В качестве источников углерода, необходимых для роста бактерий, используют соединения ароматического характера - нафталинО или соли салициловой кислоты.При замене этих источников углерода надругие, в частности на углеводы, нормальныепарафины, жирные кислоты окисление 2,6-диметилнафталина до 6-оксиметил-нафтойной5 кислоты бактериями Рзецг 1 огпопаз рц 1 Ыаштамм 7 не наблюдается.Характеристика бактерий Рзец с 1 о гп о п а з р ц 11 д а штамм 7,Штамм выделен из почвенных образцов,О взятых на территории Енакиевского коксохимического завода,Культуральные признаки; колониина твердых питательных средах гладкие, плоские, блестящие, бесцветные или серовато-бе 5 лые. На стандартной среде, предложеннойКингом и др. образует флуоресцирующийпигмент.На мясо-пептонном бульоне растет сплошной пленкой, продуцируя при этом зеленыйО флуоресцирующий пигмент, 4637023Морфология культуры; клетки палочковидные с округленными концами (1,5 - З,ОК 0,6 м), подвижные (с двумя, тремя жгутиками), грамотрицательные.Э к о л о г и ч е с к и е п р и з н а к и: растет при 4 - 37 С, не растет при 41 С, Оптимальная температура роста 28 С.Физиологические признаки: растет на обычных питательных средах органических и минеральных, ассимилирует углеводы за исключением ксилозы, На минеральных средах растет предпочтительнее с нитратной формой азота, чем с аммиачной. Желатину не разжижает, молоко не изменяет, нитраты восстанавливает, крахмал не гидролизует, инозит не усваивает.Биологические признаки; окисляет нафталин до салициловой кислоты. Салицилат окисляет полностью.Пример 1. Культуру Рзецйотопаз рц 11- Йа штамм 7 поддерживают на косяках с мясопептонным агаром (МПА), Инокулят готовят путем разведения в стерильной водопроводной воде культуры, выросшей на косяках с МПА, Плотность суспензии клеток, используемой в качестве инокулята, составляет 2,0 единицы по шкале оптической плотности нефелометра. 5 мл такого инокулята используют в качестве посевного материала на один матрац. Культуру выращивают в медицинских матрацах в течение 40 ч при 29 - 30 С на минеральной среде следующего состава, /,:КзНР 04 1,0 КНРО 4 0,1 ИН 4 ИОз 0,2 Мд 804 7 НзО 0,005ге 304 7 Н,О 0,001 СаС 1 з 6 НО 0,001 Сц 304 5 НзО 0,0002 НзВОз 0,00006 Лп 804 НзО 0,002 МПЬО 4 Н 20 0,00003 Иа,Мо 04 2 Н,О 0,003 %С 1 з 6 НзО 0,0005 Нафталин 1,0 Агар 2,0 Дистиллированная вода до 100.Среду разливают в медицинские матрацы по 250 мл в каждый и после стерилизации в течение 30 мин при 1 ати проводят заквашивание среды в матрацах,После 40 ч роста культуру смывают с агаризованной среды фосфатным буфером рН 8,5 - 8,8. Бактериальную суспензию фильтруют через стеклянный фильтр Мо 1 для отделения частиц нафталина и центрифугируют 10 мин при 8 - 10000 об/мин, дважды промывают фосфатным буфером рН 8,5 - 8,8 и ресуспепдируют в том же буфере.100 мл бактериальной суспензии с оптической плотностью 2,2 единицы вносят в медицинские колбы на 750 мл и одновременно до 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бавляют по 100 мг (0,64 моля) 2,6-диметилнафталина в каждую,Реакцию трансформации проводят при 29 - 30 С в колбах на качалке. Через 60 ч опыт заканчивают.Бактериальные клетки отделяют центрифугированием при 8 - 10 000 об/мин. Надосадочную жидкость упаривают на роторном испарителе при 40 С, концентрируя первоначальный объем в 4 - 5 раз. Сконцентрированную надосадочную жидкость охлаждают до +5 - 6 С, и к охлажденному раствору приливают четырех-пятикратный объем этилового спирта, охлажденного до 0 С, для осаждения белков. Осадок белков отделяют фильтрованием через стеклянный фильтр Мо 1, Фильтрат подкисляют 10% НС 1 до рН 3,0 и упаривают досуха на роторном испарителе при 40 С, Сухой остаток экстрагируют абсолютным этанолом и проводят препаративное выделение конечного продукта трансформации путем тонкослойной хроматографии на пластинках Я 1 ц 1 о 1 1 Лразмером 15)(15 см в системе бензол в метанол в лед уксусная кислота (45: 4: 2).В качестве элюирующего агента применяют абсолютный этанол,Элюат упаривают досуха на роторном испарителе и высушивают под вакуумом. Концентрацию конечного продукта определяют спектрофотометрически с использованием стандартных кривых. Выход продукта составляет 0,3 моля (46% ) .П р и м е р 2 Культуру Рз рШЫа штамм 7 поддерживают на косяках с МПА. Инокулят готовят как в примере 1.Культуру выращивают в течение 72 ч при 29 - 30 С на минеральной среде того же состава, что приведен в примере 1, но в качестве источника углерода добавляют 2% салицилата натрия или калия. Далее процесс трансформации 2,6-диметилнафталина и выделение конечного продукта проводят как в примере 1, Выход 6-оксиметил-нафтойной кислоты составляет 0,29 моля (45% ).Предмет изобретения1. Способ получения 6-оксиметил-нафтойной кислоты путем окисления 2,6-диметилнафталина, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода продукта, окисление проводят при помощи микроорганизмов из рода Рзецдогпопаз, выращенных на минерально-солевой среде, содержащей источники углерода в виде ароматических соединений,2, Способ по п, 1, отличающийся тем, что из рода Рзецдотопаз используют вид рц 1 Ыа.3, Способ по п, 1, отличающийся тем, что из вида Рзецдотпопаз рц 1 Ыа используют штамм 7.